universität hohenheim

155 Pages·2017·23.01 MB·German

UNIVERSITÄT HOHENHEIM

Aus dem Institut für Phytomedizin
Fachgebiet Phytopathologie
Prof. Dr. Ralf Vögele

Molekulare und biochemische Charakterisierung von
NEP1-ähnlichen Proteinen (NLPs)
aus Plasmopara viticola

Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Agrarwissenschaften

vorgelegt

der Fakultät Agrarwissenschaften

von
Stefan Hermann Schumacher
aus Ludwigsburg

2017
Die vorliegende Arbeit wurde am 15. Dezember 2016 von der Fakultät Agrarwissenschaften der
Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Agrarwis-
senschaften“ angenommen.

Tag der mündlichen Prüfung: 26. Januar 2017

Leiter der Prüfung: Prof. Dr. Thilo Streck
Berichterstatter, 1. Prüfer: Prof. Dr. Ralf Vögele
Mitberichterstatter, 2. Prüfer: Prof. Dr. Hanns-Heinz Kassemeyer
3. Prüfer: Prof. Dr. Dr. Claus P. W. Zebitz
Inhaltsverzeichnis
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Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis .................................................................................................................... V
Tabellenverzeichnis ....................................................................................................................... VI
Abkürzungen ................................................................................................................................ VII
Zusammenfassung ........................................................................................................................... X
Abstract ......................................................................................................................................... XII

1 Einleitung ............................................................................................................................. 1
1.1 Die Weinrebe .................................................................................................................... 1
1.2 Plasmopara viticola – Erreger des Falschen Mehltaus der Weinrebe .............................. 2
1.3 Die pflanzliche Immunität ................................................................................................ 6
1.3.1 PAMP-induzierte Immunität ..................................................................................... 7
1.3.2 Effektor-vermittelte Suszeptibilität ......................................................................... 10
1.3.3 Effektor-vermittelte Immunität ............................................................................... 11
1.4 Nekrosen und Ethylen induzierende Proteine ................................................................. 13
1.4.1 Vorkommen von NLPs ............................................................................................ 13
1.4.2 Charakteristika von NLPs ........................................................................................ 15
1.4.3 NLPs als Virulenzfaktoren ...................................................................................... 16
1.4.4 NLPs als Resistenzinduktoren ................................................................................. 18
1.5 Ziele dieser Arbeit .......................................................................................................... 19

2 Material und Methoden ................................................................................................ 20
2.1 Material ........................................................................................................................... 20
2.1.1 Chemikalien und Enzyme ........................................................................................ 20
2.1.2 Antikörper ................................................................................................................ 20
2.1.3 Bakterienstämme ..................................................................................................... 21
2.1.4 Kulturmedien ........................................................................................................... 22
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I
Inhaltsverzeichnis
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2.1.5 Oligonukleotide ....................................................................................................... 23
2.1.6 Pathogene ................................................................................................................ 26
2.1.7 Pflanzenmaterial ...................................................................................................... 26
2.1.8 Plasmide .................................................................................................................. 27
2.1.9 Puffer und Lösungen ............................................................................................... 28
2.2 Molekularbiologische Methoden .................................................................................... 32
2.2.1 Aufreinigung genomischer DNA............................................................................. 32
2.2.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR) .......................................................................... 32
2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................................... 33
2.2.4 Restriktionsverdau ................................................................................................... 34
2.2.5 Ligation .................................................................................................................... 34
2.2.6 Aufreinigung von RNA ........................................................................................... 35
2.2.7 Reverse Transkription von RNA ............................................................................. 35
2.2.8 Quantitative real-time PCR (qPCR) ........................................................................ 36
2.2.9 Herstellung chemisch kompetenter E. coli .............................................................. 36
2.2.10 Transformation von Mach1™-T1R / Top10 - chemisch kompetenten E. colis ....... 37
2.2.11 Kolonie-PCR ........................................................................................................... 37
2.2.12 Aufreinigung von Plasmiden aus E. coli ................................................................. 38
2.2.13 Sequenzierung von NLPs aus verschiedenen P. viticola Isolaten ........................... 38
2.2.14 Herstellung elektrokompetenter A. tumefaciens ...................................................... 39
2.2.15 Transformation von A. tumefaciens ......................................................................... 40
2.2.16 Transiente Transformation in N. benthamiana ........................................................ 40
2.2.17 Fluoreszenzmikroskopische Analyse ...................................................................... 42
2.2.18 Trypanblaufärbung zur Visualisierung einer Hypersensitiven Reaktion ................ 42
2.2.19 Co-Immunopräzipitation ......................................................................................... 43
2.2.20 Zeitreihen - Experimente mit infizierten Blattscheiben .......................................... 44
2.2.21 Zeitreihen - Experimente mit Sporangienlösung ..................................................... 45
2.2.22 Anilinblaufärbung und Mikroskopie ....................................................................... 45
2.2.23 Proteinextraktion ..................................................................................................... 46
2.2.24 SDS-Page und Western-Blot-Analysen ................................................................... 47
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II
Inhaltsverzeichnis
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2.2.25 Ortsspezifische Mutagenese .................................................................................... 47
2.2.26 Austausch funktioneller Domänen .......................................................................... 48
2.2.27 Heterologe Expression rekombinanter Proteine ...................................................... 49
2.2.28 Vakuuminfiltration von Vitis Blattscheiben ............................................................ 52
2.2.29 pH-shift-Assays ....................................................................................................... 52
2.2.30 Bioinformatische Methoden .................................................................................... 53

3 Ergebnisse ...................................................................................................... 54
3.1 Analyse der NLPs aus Plasmopara viticola (PvNLPs) .................................................. 54
3.1.1 Plasmopara viticola enthält drei für NLPs kodierende Gene .................................. 54
3.1.2 PvNLPs weisen Unterschiede innerhalb funktionsgebender Bereiche auf ............. 54
3.1.3 PvNLPs bilden ein eigenes Cluster innerhalb der NLP Superfamilie ..................... 59
3.2 PvNLP-Gene sind hoch konserviert ................................................................................ 59
3.2.1 Sequenzanalyse von PvNLP1 aus unterschiedlichen P. viticola Isolaten ............... 61
3.2.2 Sequenzanalyse von PvNLP2 aus unterschiedlichen P. viticola Isolaten ............... 62
3.2.3 Sequenzanalyse von PvNLP3 aus unterschiedlichen P. viticola Isolaten ............... 63
3.3 PvNLP-kodierende Gene werden zu Beginn der Infektion exprimiert ........................... 64
3.3.1 PvNLPs werden bereits vor Blattkontakt exprimiert ............................................... 68
3.3.2 PvNLPs werden in Abwesenheit von Blattmaterial stärker exprimiert ................... 69
3.4 Western-Blot-Analysen zum Nachweis von NLPs in P. viticola ................................... 71
3.5 PvNLPs erzeugen keine Nekrosen in Nicotiana benthamiana ....................................... 72
3.6 Domänenaustausch führt bei PvNLPs nicht zu Nekrosen induzierender Aktivität ........ 74
3.7 Subzelluläre Lokalisation von PvNLPs .......................................................................... 76
3.8 PvNLPs erzeugen keine Nekrosen in Blattscheiben verschiedener Vitis spp. ................ 76
3.9 PvNLPs bilden keine Oligomere in planta ..................................................................... 80
3.10 PvNLPs induzieren keine Abwehrreaktion in V. vinifera und anderen Vitis spp. .......... 81
3.10.1 PvNLPs haben keine Einfluss auf Ionenströme an der Plasmamembran ............... 82
3.10.2 PvNLPs induzieren keine Callose-Deposition in Vitis-Blattscheiben .................... 83

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III
Inhaltsverzeichnis
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4 Diskussion ...................................................................................................... 85
4.1 Plasmopara viticola enthält drei NLPs ........................................................................... 85
4.2 PvNLPs sind hoch konserviert ........................................................................................ 90
4.3 PvNLPs können keine Nekrosen in Pflanzen induzieren ............................................... 91
4.4 PvNLPs sind am nächsten zu anderen nicht-cytotoxischen NLPs verwandt .................. 95
4.5 PvNLPs werden zu frühen Zeitpunkten der Infektion transkribiert ................................ 98
4.6 PvNLPs sind im Cytoplasma lokalisiert ....................................................................... 103
4.7 PvNLPs bilden keine Oligomere in planta ................................................................... 105
4.8 PvNLPs induzieren keine Abwehrreaktion in Vitis spp. ............................................... 106
4.9 Mögliche neue Funktion von NLPs in biotrophen Pathogenen .................................... 108

5 Literaturverzeichnis .................................................................................... 111

6 Anhang ......................................................................................................... 128
6.1 cDNA-Sequenzen der für PvNLPs kodierenden Gene ................................................. 128
6.2 Sequenzvergleich des Gens für PvNLP1 aus Pv1306 mit PvNLP1-INRA .................... 130
6.3 Sequenzvergleich des Gens für PvNLP2 aus Pv1466 mit PvNLP2-WBI ..................... 131
6.4 Sequenzvergleich des Gens für PvNLP3 aus verschiedenen Isolaten mit .........................
PvNLP3-INRA ............................................................................................................... 133
6.5 Phylogenetisch untersuchte NLPs verschiedener Oomyceten ...................................... 135
6.6 Verwendete Isolate von Plasmopara viticola ............................................................... 136

Danksagung ................................................................................................................................. 138
Erklärung ..................................................................................................................................... 139
Lebenslauf ................................................................................................................................... 140

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IV
Abbildungsverzeichnis
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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Entwicklungszyklus von Plasmopara viticola ...................................................... 3
Abbildung 2: Symptome des Falschen Mehltaus der Weinrebe .................................................. 5
Abbildung 3: Zig-Zag-Modell der Pflanzen-Pathogen-Interaktion ............................................... 7
Abbildung 4: Darstellung konservierter Bereiche in NLPs ....................................................... 15
Abbildung 5: DNA-Sequenzvergleich der in P. viticola identifizierten NLPs .......................... 55
Abbildung 6: Vergleich der Aminosäurensequenz der in P. viticola identifizierten NLPs ....... 56
Abbildung 7: In silico-Modelle der Tertiärstruktur der drei NLPs aus P. viticola .................... 58
Abbildung 8: Darstellung der phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse von NLPs ........ 60
Abbildung 9: Darstellung des Aminosäurenaustauschs in PvNLP1 aus Isolat Pv1306 ............ 61
Abbildung 10: Darstellung des Aminosäurenaustauschs in PvNLP2 aus Isolat Pv1446 ............ 62
Abbildung 11: Darstellung des Aminosäurenaustauschs im PvNLP3 verschiedener Isolate ...... 63
Abbildung 12: Mikroskopische Aufnahmen der Infektionsstadien von P. viticola ..................... 65
Abbildung 13: Expressionsverlauf der PvNLPs auf Blattscheiben .............................................. 67
Abbildung 14: Expressionsverlauf der PvNLPs in Sporangienlösung ohne Blattkontakt ........... 68
Abbildung 15: Expressionsverlauf der PvNLPs in Sporangienlösung mit Blattkontakt ............. 70
Abbildung 16: Western-Blot zur Bestimmung der Nachweisgrenze durch anti-NLP ................. 71
Abbildung 17: Western-Blots auf infizierte Blattscheiben bzw. Sporangienlösung ................... 72
Abbildung 18: Transiente Expression von PvNLPs in N. benthamiana ...................................... 73
Abbildung 19: Schematische Darstellung der Fusionsproteine aus PvNLPs und PiNLP ............ 74
Abbildung 20: Transiente Expression von chimären Konstrukten in N. benthamiana................ 75
Abbildung 21: Subzelluläre Lokalisation von PvNLPs in N. benthamiana ................................ 77
Abbildung 22: Infiltration von rekombinantem PiNLP in N. benthamiana ................................ 78
Abbildung 23: Western-Blot auf rekombinante PvNLPs ............................................................ 79
Abbildung 24: Infiltration von rekombinanten NLPs in verschiedene Vitis spp. ........................ 79
Abbildung 25: Western-Blots zweier Co-Immunopräzipitationsexperimente ............................. 80
Abbildung 26: Vergleich der nlp20 Peptidsequenz verschiedener NLPs .................................... 82
Abbildung 27: Darstellung eines pH-shift-Experiments nach Applikation von PvNLPs ............ 83
Abbildung 28: Mikroskopische Aufnahmen der Callose-Deposition in versch. Vitis spp. ......... 84
Abbildung 29: Darstellung des Antigens von anti-NLP auf der Oberfläche von PvNLP2 ....... 101

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V
Tabellenverzeichnis
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Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Verwendete primäre Antikörper 20
Tabelle 2: Verwendete Bakterienstämme 21
Tabelle 3: Primer für qPCR 23
Tabelle 4: Primer für ortsspezifische Mutagenese von PvNLP1 23
Tabelle 5: Primer für Sequenzierungen 24
Tabelle 6: Primer für Klonierung in pET24a(+) 24
Tabelle 7: Primer für Klonierung in pamPAT / pamMCS 24
Tabelle 8: Oligonukleotide für pamMCS / pamPAT 25
Tabelle 9: Primer für Domain-Swapping 25
Tabelle 10: Verwendete Plasmide 27
Tabelle 11: Reaktionsbedingungen für FastGene® Taq-DNA Polymerase 33
Tabelle 12: Reaktionsbedingungen für PCRBIO HiFi Polymerase 33
Tabelle 13: Reaktionsbedingungen für eine "blunt ends"-Ligation 34
Tabelle 14: Reaktionsbedingungen für eine "sticky ends"-Ligation 34
Tabelle 15: Reaktionsbedingungen für SensiMix™ SYBR® & Fluorescein Kit 36
Tabelle 16: Verwendete Dialysepuffer 51
Tabelle 17: Eigenschaften von PvNLPs 57
Tabelle 18: Phylogenetisch untersuchte NLPs verschiedener Oomyceten 135
Tabelle 19: Verwendete Isolate von Plasmopara viticola 136

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VI
Abkürzungsverzeichnis
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Abkürzungen
AP Alkalische Phosphatase
ATP Adenosintriphosphat
Avr Avirulenz-Gen/Protein
BAK1 “brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1”
BBCH Biologische Bundesanstalt, Bundessortenamt und chemische Industrie
BcNLP NLP aus Botrytis cinerea
bp engl. base pair, dt. Basenpaar
BP Bandpass-Filter
BSA engl. bovine serum albumin, dt. Rinderalbumin
CBEL “cellulose binding elicitor lectin”
cDNA engl. complementary DNA, dt. komplementäre DNS
CDPK “ calcium dependent protein kinase”
CHAPS 3-[3-Cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio]-1-propansulfonat
Co-IP Co-Immunopräzipitation
Ct engl. cycle threshold, dt. Zyklusschwellenwert
cv. engl. Cultivar, dt. Kultivar
DAMP engl. damage-associated molecular pattern, dt. Schadenassoziertes molekulares
Muster
DSB engl. denaturing solubilization buffer, dt. denaturierender Solubilisations Puffer
ddH O doppelt destilliertes Wasser
2
DNA engl. deoxyribonucleic acid, dt. Desoxyribonukleinsäure
dYT engl. double yeast tryptone, dt. doppelt Hefe Trypton
EC mittlere effektive Konzentration
50
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EF-Tu “elongation factor thermo unstable”
et al. lat. et alii, dt. und andere
ETI engl. effector-triggered immunity, dt. Effektor-vermittelte Immunität
ETS engl. effector-triggered susceptibility, dt. Effektor-vermittelte Suszeptibilität
flg22 „flagelin 22“
FLS2 „flagellin-sensing 2“
g Beschleunigung
GFP engl. green fluorescent protein, dt. grün fluoreszierendes Protein
GHRHDWE Glycin- Histidin – Arginin – Histidin – Asparaginsäure – Trypthophan - Glu-
taminsäure Heptapeptidmotiv aus NLPs
GIP “glucanase inhibitor protein”
GTEN Glycerin-Tris-EDTA-NaCl
HaNLP NLP aus Hyaloperonospora arabidopsidis
Hepes 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
His Histidin
hpi engl. hours post infection, dt. Stunden nach Infektion
HR engl. hypersensitive response, dt. hypersensitive Reaktion
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
IgG Immunglobulin G
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VII
Abkürzungsverzeichnis
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INRA “Institut national de la recherche agronomique”
kb Kilobasen = 1000 Basenpaare
kDa Kilodalton = 1000 Dalton
KLH engl. Keyhole Limpet Hemocyanin, dt. Schlitzschnecken-Hämocyanin
LB “lysogeny broth” - Nährmedium
LEW engl. Lysis-Equilibration-Wash, dt. Lyse Äquilibrierung Wasch, Puffer
LRR engl. leucine-rich repeats, dt. Leucinreiche Wiederholungsdomäne
MAMP engl. microbe-associated molecular pattern, dt. Mikroben-assoziierte molekulare
Muster
MAPK engl. mitogen-activated protein kinase, dt. mitogenaktivierte Proteinkinase
MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
MMAi MS-MES-Acetosyringon Infiltrationspuffer
mRNA engl. messenger RNA, dt. Boten-RNA
mpi engl. minutes post infection, dt. Minuten nach Infektion
MpNLP NLP aus Moniliophthora perniciosa
MS Murashige-Skoog
MW engl. molecular weight, dt. Molekulargewicht
MWCO engl. molecular weight cut-off, Molekulargewichtschwelle
NB-LRR engl. nucleotide-binding - leucine-rich repeat, dt. Nukleotid-bindendes leucinrei-
ches Rezeptorprotein
NCBI “National Center for Biotechnology Information”
NEP1 “Necrosis- and Ethylene-inducing Peptide 1”
NLP engl. NEP1-like protein, dt. NEP1-ähnliches Protein
NLS engl. nuclear localization signal, dt. Kernlokalisierungssignal
nlp20 Peptid bestehend aus 20 Aminosäuren aus NLPs, wird als MAMP erkannt
NLP NLP aus Pythium aphanidermatum
Pya
NPP1 „necrosis-inducing Phytophthora protein 1”, NLP aus Phytophthora parasitica
OD optische Dichte
ORF engl. open reading frame, dt. offener Leserahmen
p19 19 kDa großes Protein, fungiert als RNA-silencing suppressor
PAMP engl. pathogen-associated molecular pattern, dt. Pathogen-assoziiertes molekulares
Muster
PaNLP NLP aus Pythium aphanidermatum
PBS engl. phosphate buffered saline, dt. Phosphatgepufferte Salzlösung
PCR engl. polymerase chain reaction, dt. Polymerase-Kettenreaktion
PEG Polyethylenglycol
pI engl. point isoelectric, dt. Isoelektrischer Punkt
PiNLP NLP aus Phytophthora infestans
PiNPP1.1 NLP aus Phytophthora infestans
PmNLP NLP aus Phytophthora megakarya
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PpNLP NLP aus Phytophthora parasitica
PR engl. pathogenesis-related, dt. Pathogenese-Protein
PRR engl. pattern recognition receptor, dt. Mustererkennungsrezeptor
PsNLP NLP aus Phytophthora sojae
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VIII