universidade do vale do paraíba instituto de pesquisa e desenvolvimento programa de engenharia

144 Pages·2014·2.7 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA
INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
PROGRAMA DE ENGENHARIA BIOMÉDICA

LÁZARO PINTO MEDEIROS NETO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE LESÕES DE
TIREÓIDE PARA DIAGNÓSTICO CLÍNICO

São José dos Campos, SP
2014
LÁZARO PINTO MEDEIROS NETO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE LESÕES DE
TIREOIDE PARA DIAGNÓSTICO CLÍNICO

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de
Pós graduação em Engenharia Biomédica, como
complementação dos créditos necessários para
obtenção do título de Mestre em Engenharia
Biomédica.

Orientador: Profa. Dra. Renata de Azevedo Canevari
Co-orientador: Prof. Dr. Aírton Abrahão Martin

São José dos Campos, SP
2014
LÁZARO PINTO MEDEIROS NETO

"CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE LESÕES DE TIREOIDE PARA O

DIAGNÓSTICO CLÍNICO."

Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia
Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa
e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte
banca examinadora:
Prof. Dr. AIRTON ABRAHÃO MARTIN (UNIVAP) _
(UNIVAP) ~:
pror. Ora. RENATA DE AZEVEDO CANEV ARI '
Prof'. Ora. Sandra Maria Fonseca da Costa
Diretor do IP&O - UniVap
São José dos Campos, 26 de fevereiro de 2014.

A esta nova conquista permitida por Deus em minha vida compartilho e dedico a
pessoas especiais que estiveram ao meu lado a todo o tempo.
Aos meus pais, Luís e Flávia pelo imenso amor e tempo dedicado e as minhas irmãs
Pâmela e Amanda, pessoas que sempre me apoiaram e que eu amo muito.
A minha família pela torcida e pelos incentivos de que tudo daria certo.
Aos meus amigos Leonel, Lia, Luciana Crumoe Liliane que souberam entender o
silêncio e o desânimo em vários momentos e sempre com as palavras certas me ajudaram.
Momentos difíceis foram vencidos e obstáculos ultrapassados com luta. Como
resultado de toda esta etapa conquistada restam as amizades verdadeiras e os belos momentos
que ficarão eternizados.
AGRADECIMENTO

Agradecer é demonstrar gratidão e a Deus eu agradeço pela vida, pela sabedoria e por
poder levantar a cada dia e compartilhar do seu amor. Em todo o tempo a orientação e o
caminho foramtraçados por Ele.
“Tudo procede para o bem daqueles que amam a Deus”Rom. 8.28.
A minha família, pais e irmãs que dedicaram grande parte de suas vidas para que mais
um sonho pudesse ser alcançado. Aos meus pais, Luís e Flávia eu agradeço por terem desde
minha infância me preparado e me ensinado a nunca desistir e batalhar sempre para
conquistar meus sonhos. As minhas irmãs Pâmela e Amanda agradeço pela cumplicidade e
pelo apoio durante esta caminhada. Agradeço a Deus pela oportunidade de realizar minha
caminhada ao lado de uma família feliz como a nossa.
Aos meus amigos... a estes não posso deixar de agradecer. Como não faço da busca de
amigos uma prioridade na minha vida, sempre sou agraciado com o surgimento de amizades
verdadeiras e que só contribuem para o meu crescimento. Agradeço muito a aluna Selen pelos
momentos passados dentro do laboratório e a biomédica Luciana Crumo que foi uma parceira
muito importante e que contribuiu muito para que eu conseguisse atingir este objetivo. Juntos
no laboratório, eu, Selen e Lu formamos uma verdadeira equipe. A Luciana Marques eu
agradeço muito pela atenção e pelos ensinamentos em biologia molecular, pois sem isso este
projeto não seria concretizado. Agradeço ao meu amigo Leonel por toda a ajuda e por tudo
que tem feito por mim e a Lia, pessoa maravilhosa que surgiu na minha vida para deixar os
dias de mestrado mais alegres. Agradeço também aos amigos que pela distância não estão ao
meu lado, mas sempre estão nos meus pensamentos.
Agradeço muito aos meus orientadores Renata Canevari e Aírton Martin pelo esforço
realizado e pela oportunidade de desenvolver este projeto tão importante. O verdadeiro mestre
é aquele que acredita em seu aluno e o proporcionam maneiras de desenvolver seus talentos.
Agradeço especialmente ao prof. Aírton pela oportunidade de desenvolver uma pesquisa em
uma área que eu não imaginava ser capaz de atuar. Isso foi muito importante e me mostrou
que nada é tão difícil que com esforço não possa ser realizado.
Aos professores e alunos do LEVB e do programa agradeço pelos ensinamentos, em
especial as professoras Renata Amadei e Maria Teresa Dejuste, com as quais eu tive a
oportunidade de desenvolver projetos que acrescentaram muito em minha vida acadêmica.
Agradeço ao professor Claudio Tellez que com muita atenção e dedicação me ensinou
importantes conceitos sobre espectroscopia Raman e ao professor Wellington Ribeiro pela
orientação durante meu estágio docência. Agradeço aos alunos Juliana Guerra, João,
Nicholas, Nathanne e Guilherme que disponibilizaram parte de seu tempo me ajudando e me
ensinando e aos meus colegas de mestrado Liliane, Cléber, Sidnei e Lia que fazem parte desta
conquista.
Agradeço ao Dr. André Bandiera, Dr. Evandro Sobroza, Dr. Claudio Cernea e Dr.
Lenine Brandão, médicos do HC-FMUSP, pela concessão das amostras para a realização
deste projeto, pela ajuda clínica e por terem desempenhado um papel importante para que os
excelentes resultados fossem alcançados. A bióloga Marina Pereira, pela grande ajuda na
confecção de lâminas histológicas e em todo o desenvolvimento do projeto.
Agradeço também a CAPES e a Fundação Valeparaibana de Ensino (FVE) pela bolsa
concedida durante todo o mestrado.
“As pessoas felizes lembram o passado com gratidão, alegram-se com o presente e encaram o
futuro sem medo”.
Epícuro (2014)
RESUMO

Os carcinomas de tireoide são os principais tipos de malignidades endócrinas com uma
incidência crescente nos últimos anos. Seu diagnóstico pode apresentar resultados
inconclusivos para algumas lesões, trazendo a necessidade da utilização de novas técnicas.
Diante disso, a espectroscopia Raman tem apresentado excelentes resultados na diferenciação
de carcinomas, por avaliar as alterações bioquímicas presentes nos tecidos bem como a
técnica de análise de expressão gênica na busca de marcadores de diagnóstico específicos.
Portanto, nosso objetivo foi buscar melhorias na discriminação entre tecido normal, lesões
benignas e malignas de tireoide pela espectroscopia Raman confocal e pela análise de
expressão gênica por Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (qRT-PCR). Para isso
foi utilizado um total de 35 amostras de tecido de tireoide, sendo 10 normais, 10 bócios, 10
carcinomas papilíferos (CPT) e 5 carcinomas foliculares (CFT), que foram analisadas pela
técnica de espectroscopia Raman confocal e os espectros obtidos processados pelos
softwaresLabspec5, Origin 8.6 e OPUS®. A análise estatística para a separação das amostras
foi realizada pelo programa Minitab®. Para a análise de expressão gênica foram utilizados 33
amostras sendo 4 normais, 14 bócios, 11 CPT e 4 CFT. Foi extraído o RNA das amostras
seguido pela síntese do cDNA e análise por qRT-PCR. A análise dos resultados foi feita pelo
método Delta-Delta Ct (ΔΔCt) e do método da curva-padrão e a estatística pelo software
GraphPad 3.0. Importantes diferenças de intensidade em alguns modos vibracionais foram
encontradas entre os tipos histológicos analisados em relação ao tecido normal pela
espectroscopia Raman. A análise multivariada possibilitou uma discriminação de 63% entre
todos os tipos histológicos, 77% para a comparação entre tecido normal e bócio, 88,9% entre
normal e CPT, 91,1% entre normal e CFT, 85,5% entre bócio e CPT, 84,8% entre bócio e
CFT e de 84,6% entre CPT e CFT. Pela análise de expressão gênica foi encontrado diferenças
significativas para genesLGALS3 nas comparações entre bócio versus CPT e bócio versus
CFT, SERPINA1 para o grupo bócio versus CPT e CPT versus CFT, TG na comparação entre
bócio versus CPT e TFF3 para o grupo bócio versus CFT e CPT versus CFT. Com base nos
resultados obtidos, a técnica de espectroscopia Raman confocal e a análise de expressão
gênica apresentaram importantes resultados na detecção de alterações bioquímicas e
moleculares das lesões de tireoide e na discriminação entre os tecidos, se mostrando
excelentes ferramentas no auxílio diagnóstico de lesões de tireoide bem como de outras
patologias.

Palavras-chave: Espectroscopia Raman. Análise de Expressão Gênica. Câncer de Tireoide;
Tireoide.
ABSTRACT

Thyroid carcinomas are the main types of endocrine malignancies with a growing incidence in
recent years. Its diagnosis may produce inconclusive results for some injuries bringing the
need for new techniques. Thus, Raman spectroscopy has shown excellent results in the
differentiation of carcinoma by assessing the biochemical alterations present in the tissuesas
well as analysis of gene expression in the search for specific markers for diagnosis. Therefore
our goal was to find improvements in the discrimination between normal tissue, benign and
malignant thyroid lesions by confocal Raman spectroscopy and analysis of gene expression
by qRT-PCR. In this work, a total of 35 samples from thyroid tissue being 10 normal tissues,
10 goiter tissues, 10 papillary carcinomas (PTC) and 5 follicular carcinoma (FTC) were
analyzed by confocal Raman spectroscopy and the spectra obtained were processed by the
Labspec5 software, Origin 8.6 and OPUS ®. The statistical analysis for the separation of
samples was performed by Minitab ®.For gene expression analysis 33 samples were used
being 4 normal, 14 goiters, 11 PTC and 4FTC. The RNA was extracted from the samples
followed by cDNA synthesis and analysis by qRT-PCR. The analysis of results was
performed by the Delta-Delta Ct (ΔΔCt) method and the standard curve method. Statistical
analysis was performed by GraphPad 3.0 software.Important differences in the intensity of
some vibrational modes were found between histologic types analyzed in relation to normal
tissue by Raman spectroscopy. The multivariate analysis allowed discrimination of 63%
among all the histological types, 77% for the comparison between normal tissue and goiter,
88.9 % between normal and PTC, 91.1% between normal and FTC, 85.5% between goiter and
PTC, 84.8% between goiter and FTC and 84.6 % between PTC and FTC. The gene
expression analysis found significant differences for genes: LGALS3in the comparisons
between goiter vs PTC and goiter vs FTC, SERPINA1 for goiter group vs PTC and PTC vs
FTC, TG in the comparison between goiter vs PTC and TFF3 for goiter group vs FTC and
PTC vs FTC.Based on these results,the confocal Raman spectroscopy and gene expression
analysis showed significant results in the detection of biochemical and molecular changes of
thyroid lesions and discrimination between tissues, showing excellent tools for the diagnosis
of thyroid lesions as well as other pathologies.

Keywords: Raman Spectroscopy. Gene Expression Analysis. Thyroid Cancer. Thyroid.