Transcriptoma comparativo e redes de co-expressão gênica associados a características de ...

143 Pages·2017·3.49 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

BÁRBARA SILVA VIGNATO

Transcriptoma comparativo e redes de co-expressão gênica associados a
características de carcaça de bovinos Nelore

Pirassununga
2017
BÁRBARA SILVA VIGNATO

Transcriptoma comparativo e redes de co-expressão gênica associados a
características de carcaça de bovinos Nelore
VERSÃO CORRIGIDA

Tes e apresentada à Faculdade de Zootecnia
e Engenharia de Alimentos da Universidade
de S ão Paulo, como parte dos requisitos para
a obtenção do Título de Doutor em Ciências
do programa de pós-graduação em
Zootecnia.

Área de Concentração: Qualidade e
Produtividade Animal

Orientador: Prof. Dr. Júlio Cesar de

Carvalho Balieiro

Pirassununga
2017
Ficha catalográfica elaborada pelo
Serviço de Biblioteca e Informação, FZEA/USP,
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Silva-Vignato, Bárbara
S586t Transcriptoma comparativo e redes de co-
expressão gênica associados a características de
carcaça de bovinos Nelore / Bárbara Silva-Vignato ;
orientador Prof. Dr. Júlio Cesar de Carvalho
Balieiro. -- Pirassununga, 2017.
141 f.

Tese (Doutorado - Programa de Pós-Graduação em
Zootecnia) -- Faculdade de Zootecnia e Engenharia
de Alimentos, Universidade de São Paulo.

1. Área de olho de lombo. 2. Espessura de
gordura subcutânea. 3. Longissimus dorsi. 4. RNA-
Seq. 5. WGCNA. I. Balieiro, Prof. Dr. Júlio Cesar
de Carvalho, orient. II. Título.

Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte - o autor
DEDICATÓRIA

A minha mãe, Angélica, pelo imenso amor. Por ser minha mãe e minha
melhor amiga.
A minha pequena grande irmã, Deborah, pelos incontáveis bons
momentos em nossas “vidas de fuinha”.
Ao meu marido Renan, meu amor. Por toda sua dedicação e
compreensão nesse período. Obrigada por estar sempre ao meu lado.
As minhas duas avós, Marlene (in memorian) e Antonieta, por me
fazerem sempre sorrir e me dedicarem tanto carinho. A vó Marlene
dedico minha eterna saudade, você foi e sempre será maravilhosa.

Amo vocês...
...e sem vocês eu não teria chegado até aqui!
AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço imensamente a Deus, por ter me guiado durante
esta caminhada.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Júlio Cesar de Carvalho Balieiro, pela orientação
e pela confiança durante estes quatro anos de doutorado.
Ao Prof. Dr. Luiz Lehmann Coutinho, a Dr. Luciana Correia de Almeida
Regitano e o Prof. Dr. Gerson Barreto Mourão, por me aceitarem como integrante de
seu projeto temático e por toda colaboração em minha formação.
A Universidade de São Paulo, em especial a Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos, pelos anos de casa.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes),
pela bolsa concedida.
A Mirele Poleti e a Aline Cesar, pela amizade, paciência e por todos os
ensinamentos transmitidos. A contribuição de vocês foi essencial.
A Cristina Moncau, pela amizade durante todos esses anos, e por toda a força
e incentivo durante a caminhada.
A Simone Oliveira pela grata amizade e por todo incentivo.
A Alessandra Rosa, Mikaele Pereira e Leydiana Fonseca pela contribuição e
parceria no laboratório.
A todos os integrantes do projeto temático, da Esalq e da Embrapa, obrigada
por me fazerem sentir parte da equipe.
Ao meu pai, Ariovaldo, por todas as lições de casa, trabalhos escolares, e noites
resolvendo problemas de matemática. Amo você.
A minha maravilhosa família Silva-Vignato, sem o apoio de vocês eu não
conseguiria chegar até aqui. Tio César, Vitória, Sophia, D. Cida, S. Nino, Jucelena,
Ana Giulia, Maria Eduarda, Joceli (Tata)... amo vocês.
A grande amiga/link Cindy Ioshida (Kuia), pelos incontáveis bons momentos.
Foi com você que pisei a primeira vez em um laboratório.
Ao amigo/irmão, David Sampaio, por me ouvir e me aconselhar sempre.
As minhas filhas de quatro patas, Tita e Nina, pelo amor mais simples e sincero.
Aos amigos conquistados durante minha estadia aqui na FZEA, a turma da
APG (Associação de Pós-Graduandos)... seria injusto citar nomes e esquecer alguém.
Todos vocês também fizeram parte de quem eu sou hoje.
A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para realização deste
trabalho.

Sou imensamente grata!
"A vida nem sempre segue a nossa vontade,
mas ela é perfeita naquilo que tem que ser."
Chico Xavier
SILVA-VIGNATO, B. Transcriptoma comparativo e redes de co-expressão gênica
associados a características de carcaça de bovinos Nelore. 2017. 141f. Tese
(Doutorado) – Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de
São Paulo, Pirassununga, 2017.

RESUMO
O objetivo deste trabalho foi estudar o transcriptoma do músculo Longissimus dorsi
(LD) de bovinos da raça Nelore associado as características de área de olho de lombo
(AOL) e espessura de gordura subcutânea (EGS), a fim de encontrar genes
diferencialmente expressos (GDE), conjuntos de genes co-expressos, vias
metabólicas e processos biológicos que regulam essas características. Foram
utilizados dados de 385 bovinos Nelore castrados para obtenção das medidas
fenotípicas de AOL e EGS, mensuradas entre a 12ª e 13ª costelas do músculo LD.
Estes animais foram separados em dois grupos extremos, alto e baixo, contendo seis
animais cada, baseados nos valores genômicos estimados (GEBV), para AOL e para
EGS. Estes conjuntos de 12 animais foram submetidos à análise de expressão
diferencial afim de encontrar GDE entre os grupos. Em seguida, a análise de
enriquecimento funcional a partir da lista de GDE foi executada por meio do DAVID
(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) e da combinação
do BiNGO (Biological Networks Gene Ontology) e REVIGO (Reduce + Visualise Gene
Ontology). Para AOL, foram identificados 101 GDE entre os grupos de alto e baixo
GEBV. Desses, 72 genes apresentaram-se down-regulated e 29 up-regulated no
grupo baixo. Para EGS, foram encontrados 18 GDE, dos quais treze apresentaram-
se up-regulated e cinco down-regulated no grupo baixo. Dentre as vias metabólicas e
processos biológicos encontrados para essas características, destacam-se a via de
sinalização MAPK (bta04010) e a via da endocitose (bta04144) – AOL – e, os
processos de biossíntese de andrógenos (GO:0006702) e via de sinalização canônica
Wnt (GO:0060070) – EGS. Para encontrar conjuntos de genes co-expressos
associados aos tratamentos (AOL e EGS), foi utilizado o pacote WGCNA (Weighted
Correlation Network Analysis) do R, com dados de contagens de transcritos de 43
animais. Foram identificados 37 módulos, dentre eles, os módulos Azul, Verde-escuro
e Salmon apresentaram correlação significativa de 0,3 com a EGS (P<0,10). Os genes
destes módulos foram selecionados para análise de enriquecimento funcional quando
seus valores de filiação ao módulo foram superiores a 0,7. O módulo azul apresentou
o maior número de genes co-expressos, com 953 genes submetidos à análise de
enriquecimento funcional. Foram encontradas seis vias metabólicas e 101 termos do
Gene Ontology para este módulo, conforme análise do DAVID, além de 108 processos
biológicos identificados pelo BiNGO/REVIGO. Os resultados do presente estudo
enfatizam a complexidade da regulação gênica do músculo LD de bovinos Nelore
associado às características de AOL e EGS. Estes resultados nos auxiliam a
compreender melhor os diversos processos moleculares envolvidos na deposição
muscular e de gordura de cobertura, características de carcaça economicamente
importantes para a produção da carne bovina.

Palavras-chave: Área de olho de lombo. Espessura de gordura subcutânea.
Longissimus dorsi. RNA-Seq. WGCNA.
SILVA-VIGNATO, B. Comparative transcriptome and gene co-expression
networks associated with carcass traits of Nellore cattle. 2017. 141p. Thesis
(PhD) – Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São
Paulo, Pirassununga, 2017.

ABSTRACT
The aim of this work was to study the Longissimus dorsi (LD) muscle transcriptome of
Nellore cattle associated with ribeye area (REA) and backfat thickness (BFT) to find
differentially expressed genes (DEG), coexpressed gene modules, metabolic
pathways, and biological processes that regulate these traits. Data from 385 Nellore
steers were used to obtain the phenotypic measures of REA and BFT, measured
between the 12th and 13th ribs of the LD muscle. These animals were divided into two
extreme groups, high and low, with six animals each, based on the estimated genomic
breeding values (GEBV) for REA and for BFT. These sets of 12 animals were
submitted to differentially expressed gene analysis to find DEG between the groups.
Then, the functional enrichment analysis from the list of DEG was performed by DAVID
(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) and the combination
of BiNGO (Biological Networks Gene Ontology) and REVIGO (Reduce + Visualize
Gene Ontology). For REA, 101 DEG were identified between the high and low GEBV
groups. Of those, 72 genes were down-regulated and 29 up-regulated in the low group.
For BFT, 18 DEG were found, of which thirteen were up-regulated and five were down-
regulated in the low group. Among the metabolic pathways and biological processes
found for these traits, the MAPK signaling pathway (bta04010) and the endocytosis
pathway (bta04144) – for REA –, the androgen biosynthetic processes (GO: 0006702)
and the canonical Wnt signaling pathway (GO: 0060070) – for EGS – can be
highlighted. To find coexpressed gene modules associated with the traits (REA and
BFT), we used the WGCNA (Weighted Correlation Network Analysis) package from R,
with data from transcript counts of 43 animals. A total of 37 modules were founded.
Among them, the Blue, Dark Green and Salmon modules had a significant correlation
of 0.3 with BFT (P<0.10). The genes of these modules were selected for functional
enrichment analysis when their module membership values were higher than 0.7. The
blue module had the highest number of co-expressed genes, with 953 genes submitted
to functional enrichment analysis. Six metabolic pathways and 101 Gene Oontology
terms were founded for this module by DAVID analysis, in addition, 108 biological
processes were identified by BiNGO/REVIGO. The results of the present study
emphasize the complexity of gene regulation in the LD muscle of Nellore cattle
associated with REA and BFT. These results can help us to better understand the
different molecular processes involved in muscle and fat deposition, which are
economically important carcass traits for beef production.

Keywords: Backfat thickness. Longissimus dorsi. Ribeye area. RNA-Seq. WGCNA.
LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Gráfico das estimativas de dispersão do nível de expressão gênica para
animais selecionados para a característica área de olho de lombo .......................... 30
Figura 2 – Volcano plot do log2FoldChange versus –log10 do valor de P, dos grupos
alto e baixo baseados nos valores genômicos estimados (GEBV) para área de olho
de lombo de bovinos Nelore ..................................................................................... 30
Figura 3 – Gráfico das estimativas de dispersão do nível de expressão gênica para os
animais selecionados para a característica espessura de gordura subcutânea ....... 42
Figura 4 – Volcano plot do log2FoldChange versus –log10 do valor de P, dos grupos
alto e baixo baseados nos valores genômicos estimados (GEBV) para espessura de
gordura subcutânea de bovinos Nelore .................................................................... 42
Figura 5 – Dendograma de clusterização dos genes com dissimilaridade baseada na
sobreposição topológica, e cores designadas aos módulos ..................................... 49
Figura 6 – Correlações entre módulos eigengene (ME) e medidas de área de olho de
lombo (AOL) e espessura de gordura subcutânea (EGS) ........................................ 50
Figura 7 – Processos biológicos associados aos genes presentes no Módulo Azul
(FDR<0,05). Os dez processos mais significativos aparecem em destaque ............ 52