TESIS Para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de DOCTOR EN ...

139 Pages·2005·2.82 MB·Spanish

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR
DE ENSENADA

PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS
CON ORIENTACIÓN EN ACUICULTURA

ANÁLISIS CITOGENÉTICO EN TRES ESPECIES DE ABULONES DE BAJA
CALIFORNIA MEDIANTE PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES

TESIS
Para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de
DOCTOR EN CIENCIAS

Presenta:
Cristian Jorge Gallardo Escarate

Ensenada, Baja California, México, Abril de 2005.
INDICE GENERAL

Acta de aprobación de tesis.....................................................................................................i
Resumen.................................................................................................................................ii
Abstract.................................................................................................................................iii
Dedicatoria............................................................................................................................iv
Agradecimientos.....................................................................................................................v
Indice de figuras...................................................................................................................vii
Indice de tablas.......................................................................................................................x

................................................................................1
................................................................................8
Generales............................................................................................................................8
Específicos..........................................................................................................................8
................................................................................9
III. 1. Importancia de abulones en acuicultura..................................................................9
III. 2. Introducción a la genética de abulones..................................................................11
III.3. El valor de estudios citogenéticos...........................................................................15
1. 3. 1. Citogenética molecular.....................................................................................16
1. 3. 2. Citogenética de organismos acuáticos.............................................................19
1. 3. 3. Citogenética de moluscos.................................................................................19
1. 3. 4. Implicaciones de tamaño genómico..................................................................22
1. 3. 5. Análisis de imágenes como una herramienta en citogenética..........................25
..............................................................................28
IV. 1. Obtención de cariotipos en abulones a partir de larvas.........................................28
4. 1. 1. Obtención de organismos.................................................................................28
4. 1. 2. Obtención de placas metafásicas......................................................................29
4. 1. 3. Tratamiento hipotónico.....................................................................................29
4. 1. 4. Fijación.............................................................................................................29
4. 1. 5. Confección de preparaciones...........................................................................29
4. 1. 6. Desarrollo de cariotipos...................................................................................30
IV. 2. Procedimientos de FISH para la localización cromosómica de genes..................31
4. 2. 1. FISH para ADNr 18S+5.8S+ 28S....................................................................31
4. 2. 2. FISH para regiones Teloméricas y GATA........................................................34
4. 2. 3. Detección inmunocitoquímica..........................................................................35
IV. 3. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata.....35
IV. 4. Desarrollo de un método para estimar tamaño genómico mediante análisis de
imagenes fluorescentes.....................................................................................................36
4. 4. 1. Material biológico............................................................................................36
4. 4. 2. Recolección de muestras y preparación celular para tinción de ADN..........37
4. 4. 3. Captura de imágenes........................................................................................38
4. 4. 4. Análisis de imágenes fluorescentes...................................................................39
IV. 5. Estimación de contenido de ADN cromosómico en abulón rojo H. rufescens.......41
4. 5. 1. Preparación de cromosomas y tinción de ADN................................................41
4. 5. 1. Análisis de imágenes en contenidos de ADN cromosómicos............................41
4. 5. 2. Análisis estadístico...........................................................................................42
IV. 6. Estimación de tamaño genómico en Argopecten purpuratus.................................42
4. 6. 1. Material biológico............................................................................................42
4. 6. 2. Obtención de hemocitos y tinción fluorescente de ADN...................................43
4. 6. 3. Análisis estadístico...........................................................................................43
..............................................................................44
V. 1. Cariotipo cuantitativo de Haliotis rufescens............................................................44
V. 2. Cariotipo cuantitativo de Haliotis fulgens...............................................................47
V. 3. Cariotipo cuantitativo de Haliotis corrugata...........................................................50
V. 4. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis rufescens............................................53
V. 5. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis fulgens................................................55
V. 6. Hibridación in situ fluorescente en Haliotis corrugata...........................................56
V. 7. Relaciones cromosómicas entre H. rufescens, H. fulgens y H. corrugata...............60
V. 8. Estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescentes......63
5. 8. 1. La naturaleza del desvanecimiento DAPI-fluorescentes..................................63
5. 8. 2. La relación entre desvanecimiento DAPI-fluorescente y tamaño genómico....69
V. 9. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo del Pacífico Haliotis rufescens..75
V. 10. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus.82
5. 10. 1. Mediciones morfológicas................................................................................82
5. 10. 2. Análisis de tamaño genómico mediante desvanecimiento fluorescente.........82
..............................................................................87
VI. 1. Relaciones cromosómicas entre Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata.....87
VI. 2. Desarrollo de citogenética molecular en moluscos: aplicación en abulones de
Baja California.................................................................................................................92
VI. 3. Desarrollo de un método de cuantificación de contenido de ADN genómico
mediante análisis de imágenes fluorescentes...................................................................96
VI. 4. Contenido de ADN cromosómico en abulón rojo Haliotis rufescens...................100
VI. 5. Estimación de tamaño genómico en dos poblaciones de Argopecten purpuratus
mediante análisis de imágenes fluorescentes.................................................................102
............................................................................105
............................................................................109
i
TESIS DEFENDIDA POR
Cristian Jorge Gallardo Escarate
Y APROBADA POR EL SIGUIENTE COMITÉ

Dr. Josué Álvarez Borrego Dr. Miguel Ángel del Río Portilla
Director del Comité Co-Director del Comité

Dra. Carmen Paniagua Chávez Dr. Axayácatl Rocha Olivares
Miembro del Comité Miembro del Comité

Dr. Jorge de la Rosa Vélez
Miembro del Comité

Dra. Mónica Hernández Rodríguez Dr. Federico Graef Ziehl

Coordinador del Programa de Director de Estudios de Posgrado

Posgrado en Ciencias con
Orientación en Acuicultura

Abril de 2005
ii
RESUMEN de la tesis que presenta Cristian Gallardo Escarate, presentada como requisito
parcial para la obtención del grado de DOCTOR EN CIENCIAS con especialidad en
ACUICULTURA. Ensenada, Baja California, México. Abril de 2005.

ANÁLISIS CITOGENÉTICO DE TRES ESPECIES DE ABULONES DE BAJA
CALIFORNIA MEDIANTE PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES

Resumen aprobado por:

Dr. Josué Álvarez Borrego Dr. Miguel Ángel del Río Portilla
Director del Comité Co-Director del Comité

El objetivo fundamental de la citogenética es analizar cómo la estructura y comportamiento de
los cromosomas garantizan la conservación de la información genética a través de la herencia.
Asimismo se estudian las variaciones que afectan a los cromosomas, sus consecuencias genéticas y
sus implicaciones evolutivas.
El objetivo del presente trabajo doctoral fue caracterizar citogenéticamente tres especies de
abulones de Baja California mediante procedimientos de análisis de imágenes. Para lo cual, se
obtuvieron células larvales de Haliotis rufescens, H. fulgens y H. corrugata. El análisis cariotípico
mostró que las tres especies estudiadas presentan un número diploide de 2n=36 cromosomas. Sin
embargo, la relación de longitudes de los brazos cromosómicos mostró que H. rufescens posee
8M+9SM+1ST pares cromosómicos, H. fulgens posee 8M+8SM+2ST y H. corrugata posee
10M+7SM+1ST.
El uso de sondas ribosómicas mediante FISH, permitió la localización de dos clusters de genes
ribosómicos 18S-5.8S-28S que integran las NOR’s. De este modo, en todas las especies estudiadas
se localizó un NOR sobre el cromosoma 4, mientras que un segundo NOR fue observado sobre el
cromosoma 5 de H. rufescens, cromosoma 11 de H. fulgens y cromosoma 2 de H. corrugata.
Adicionalmente, regiones teloméricas (TTAGGG) y (GATA) fueron encontradas en el genoma de
n n
los abulones mediante FISH para estos tipos de secuencias.
Los análisis estadísticos sobre la morfología cromosómica, mostraron que de los 18 pares
cromosómicos de cada especie, 8 pares son similares en las tres especies estudiadas, 3 pares son
propios de H rufescens, 7 pares de H. fulgens y 2 pares de H. corrugata. Las relaciones
cromosómicas mostraron que H. rufescens y H. corrugata son entre sí citogenéticamente más
similares que cualquiera de ellas con respecto a H. fulgens.
Adicionalmente, el presente trabajo propuso un nuevo método de estimación de tamaño
genómico mediante la cuantificación de desvanecimiento DAPI-fluorescente. La relación entre los
valores de desvanecimiento fluorescente de un organismo u especie y su tamaño genómico fue
encontrada estadísticamente significativa (p<0.001) y lineal (r = 0.99). Una aplicación directa fue
desarrollada para cuantificar el contenido de ADN cromosómico en H. rufescens y para estimar el
tamaño genómico de dos poblaciones de Argopecten purpuratus.
En conclusión, el presente trabajo doctoral aporta nueva información citogenética de tres
especies de abulones de Baja California. Asimismo, aporta con el desarrollo de un nuevo método de
estimación de tamaño genómico mediante análisis de imágenes fluorescente.

Palabras clave: Cariotipos, FISH, H. rufescens, H. fulgens, H. corrugata, análisis de imágenes,
tamaño genómico.
iii
ABSTRACT of the Thesis presented by Cristian Gallardo Escarate as a partial requirement to
obtain the DOCTOR IN SCIENCE degree with orientation in AQUACULTURE. Ensenada, Baja
California, México. April 2005.

CITOGENETIC ANALYSIS OF THREE ABALONE SPECIES FROM BAJA
CALIFORNIA BY MEANS OF DIGITAL IMAGE PROCESSING

Abstract approved by:

Dr. Josué Álvarez Borrego Dr. Miguel Ángel del Río Portilla
Director del Comité Co-Director del Comité

The fundamental aim of the cytogenetics is to analyze how both structural and behavior of the
chromosomes guarantee the conservation of the genetics information throughout the inheritance.
Likewise, the variations that could be affect to the chromosomes, its genetic consequences, and
evolutionary implications are studied.
The aim of the present doctoral work was to characterize cytogenetically three abalone species
from Baja California by means of image analysis procedures. Thus, larvae cells were obtained from
Haliotis rufescens, H. fulgens, and H. corrugata. Karyotype analysis showed that all studied species
have a diploid number of 2n=36 chromosomes. However, the relationship of chromosomal arms
lengths showed that H. rufescens has 8M+9SM+1ST chromosome pairs, H. fulgens has
8M+8SM+2ST, and H. corrugata has 10M+7SM+1ST.
The using of ribosomal probes by means of FISH, allowed to locate two clusters of ribosomal
genes 18S-5.8S-28S that form the NOR’s. In this way, in all the studied abalone species was
localized one NOR onto the chromosome 4, while one second NOR was observed onto the
chromosome 5 of H. rufescens, chromosome 11 of H. fulgens, and chromosome 2 of H. corrugata.
Furthermore, both telomeric (TTAGGG) and (GATA) regions were found in the abalone’s
n n
genome by means of FISH for these kinds of sequences.
Statistical analyses carried out on the chromosomal morphology showed that in the 18
chromosome pairs of each species, 8 pairs are similar in the three studied species, and 3 pairs
belongs to H rufescens, 7 pairs to H. fulgens, and 2 pairs to H. corrugata. Chromosome
relationships showed that both H. rufescens and H. corrugata are cytogenetically most similar than
anyone with respect to H. fulgens.
In addition, the present work proposed a new method for genome size estimation by means of
DAPI-fluorescent fading quantification. The relationship between the fluorescent fading values of
an organism or species, and its genome size was found statistically significative (p<0.001) and
lineal (r = 0.99). A direct application was performed in order to quantify the chromosomal DNA
content in H. rufescens, and to estimate genome size of two populations of Argopecten purpuratus.
In conclusions, the present doctoral work contributes with new cytogenetic information of three
abalone species from Baja California. Likewise, It is contributes with a new method for genome
size estimation by mean of fluorescent image analysis.

Key words: Karyotypes, FISH, H. rufescens, H. fulgens, H. corrugata, image analysis, genome
size.
iv

A mí amada Paty
y a mi hijo Cristian Ignacio
v

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo económico, a
través a los siguientes proyectos de investigación:
- Proyecto 36075-B "Procesado Automático de Partículas Biogénicas", a cargo del Dr.
Josué Álvarez Borrego.
- Proyecto 33018-B “Marcadores genéticos en el abulón Haliotis spp.”, a cargo del Dr.
Miguel Ángel del Río-Portilla.
- Programa Integral de Fortalecimiento del Posgrado, Departamento de Acuicultura,
CICESE.

Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada por el apoyo
económico, a través a los siguientes proyectos:
- Proyecto Interno CICESE 7090, de la División de Física Aplicada, Departamento de
Óptica "Procesamiento de Patrones Complejos y de Superficies Marinas", a cargo del
Dr. Josué Álvarez Borrego.
- Proyecto Interno CICESE 6555, de la División de Oceanología, Departamento
Acuicultura "Genética molecular de especies acuiculturales", a cargo del Dr. Miguel
Ángel del Río-Portilla.

Al programa de Becas para Estudios de Postgrado de la Comisión Nacional de
Investigación Científica y Tecnológica (CONICyT) convenio BID, Chile.

Al programa de Becas para Estudios de Postgrado de la Organización de los Estados
Americanos (OEA).