Syntrophe Oxidation der Fettsäure Acetat und des biogenen Amins Cadaverin

120 Pages·2010·5.5 MB·German

Syntrophe Oxidation der Fettsäure Acetat und des biogenen
Amins Cadaverin (1,5-Diaminopentan) durch definierte
methanogene Kokulturen

Dissertation
Zur Erlangung des akademischen Grades
des Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
an der Universität Konstanz
Fachbereich Biologie

vorgelegt von

Julia Christine Yvonne Röder

Tag der mündlichen Prüfung: 10.09.2010
Referent: Prof. Dr. Bernhard Schink, Universität Konstanz
Referent: Prof. Dr. Alisdair Cook, Universität Konstanz
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ..............................................................................................................5
2 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................8
3 Einleitung ..........................................................................................................................11
3.1 Syntrophie und revertierter Elektronentransport .................................................................... 11
3.2 Vorkommen und Verbreitung von Cadaverin........................................................................... 12
3.3 Vorkommen und Verbreitung von Acetat ................................................................................ 14
3.4 Ziele der Arbeit ........................................................................................................................ 17
4 Material und Methoden ....................................................................................................18
4.1 Chemikalien ............................................................................................................................. 18
4.2 Mikrobiologische Methoden .................................................................................................... 18
4.2.1 Herkunft der Organismen.................................................................................................................. 18
4.2.2 Nährmedium für die Cadaverin-oxidierende Kultur............................................................................ 18
4.2.3 Herstellung des Grundmediums ........................................................................................................ 20
4.2.4 Nährmedium für Thermacetogenium phaeum DSMZ 880 .................................................................. 20
4.2.5 Herstellung des DSMZ 880 Mediums ................................................................................................. 23
4.2.6 Natriumfreies Nährmedium für Thermacetogenium phaeum DSMZ 880 ............................................ 23
4.2.7 Herstellung des natriumfreien DSMZ 880 Mediums ........................................................................... 25
4.2.8 Nährmedium der Acetat-oxidierenden Kokultur SYNAC DSMZ 318 ................................................... 26
4.2.9 Herstellung des DSMZ 318 Mediums ................................................................................................. 28
4.2.10 Komplexmedien ............................................................................................................................. 28
4.2.11 Substratlösungen für Wachstumsversuche der Kokultur LC 13M...................................................... 28
4.2.12 Verdünnungsreihe in Flüssigmedium zur Reinkultivierung anaerober Bakterien .............................. 28
4.2.13 Stammhaltung und Kultivierungstechniken ..................................................................................... 29
4.2.14 Bestimmung von Wachstumsparametern ........................................................................................ 29
4.2.15 Wachstumsversuche mit der Kokultur LC 13M................................................................................. 30
4.2.16 Substratspektrum der Kokultur LC 13M ........................................................................................... 30
4.2.17 Temperatur-, pH-Optimum, Salz- und Phosphattoleranz .................................................................. 31
4.2.18 Auswirkung von Na+ auf das Wachstumsverhalten des acetogenen Bakteriums Thermacetogenium
phaeum .......................................................................................................................................... 31
4.2.19 Elektronentransport zwischen den Partnern der Acetat-oxidierenden Kokultur Synac...................... 32
4.3 Beschreibung von Bakterienisolaten ........................................................................................ 32
4.3.1 Agarosebeschichtete Objektträger modifiziert nach Wagener et al. 1986 .......................................... 32
4.3.2 Bestimmung des Gram-Typs der Zellwand ......................................................................................... 33
4.3.3 Geißelfärbung ................................................................................................................................... 33
4.3.4 Nachweis von Cytochromen .............................................................................................................. 33
4.4 Nasschemische Analysen ......................................................................................................... 33
4.4.1 Photometrische Tests ....................................................................................................................... 33
4.5 Chromatographische Methoden .............................................................................................. 34
4.5.1 Gaschromatographie mit FID............................................................................................................. 34
4.5.2 Gaschromatographie mit WLD .......................................................................................................... 34
4.5.3 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie / High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)................... 35
4.6 Biochemische Methoden ......................................................................................................... 36
4.6.1 Mikro-Proteinbestimmung (nach Pierce) ........................................................................................... 36
4.6.2 Anoxische Zellernte der methanogenen Kokultur LC 13M .................................................................. 37
4.6.3 Anoxische Zellernte der methanogenen Kokultur Synac .................................................................... 37
4.6.4 Enzymtests ....................................................................................................................................... 38
4.7 Molekularbiologische Methoden ............................................................................................. 40
4.7.1 Polymerasekettenreaktion (Kokultur LC 13M) ................................................................................... 40
4.7.2 Reinigung der PCR-Produkte ............................................................................................................. 41
4.7.3 Agarosegelelektrophorese ................................................................................................................ 42
4.7.4 Sequenzierung .................................................................................................................................. 42
4.7.5 SDS Gelelektophorese ....................................................................................................................... 42
4.7.6 Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen mit kolloidalem Coomassie-Blau .............................................. 42
4.7.7 2D Gelelektophorese ........................................................................................................................ 43
4.7.7.1 Isoelektrische Fokussierung ......................................................................................................... 43
4.7.7.2 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese.......................................................................................... 43
5 Ergebnisse .........................................................................................................................45
5.1 Syntrophe Cadaverinoxidation durch eine methanogene Kokultur LC 13M ............................. 45
5.1.1 Isolierung und Charakterisierung einer methanogenen Kokultur LC 13M ausgehend von der
sulfatreduzierenden Kokultur LC 13d .............................................................................................. 45
5.1.1.1 Isolierung mittels Verdünnungsreihen in Flüssigmedium .............................................................. 45
5.1.1.2 Charakterisierung der methanogenen Kokultur LC 13M ............................................................... 45
5.1.1.3 Biochemie der methanogenen Kokultur LC 13M .......................................................................... 50
5.1.1.4 Phylogenie der methanogenen Kokultur LC 13M.......................................................................... 52
5.2 Syntrophe Acetatoxidation durch eine methanogene Kokultur Synac ..................................... 53
5.2.1 Cytologische Eigenschaften der Reinkultur Thermacetogenium phaeum bzw. der Kokultur Synac ...... 53
5.2.2 Physiologische Eigenschaften der Reinkultur Thermacetogenium phaeum bzw. der Kokultur SYNAC .. 54
5.2.2.1 Einfluss von Na+ auf das Wachstum und die Produktbildung des acetogenen Bakteriums
Thermacetogenium phaeum ...................................................................................................... 54
5.2.2.2 Elektronentransfer zwischen den Partnern der Kokultur Synac..................................................... 56
5.2.2.3 Cytochrome des acetogenen Bakteriums Thermacetogenium phaeum ......................................... 56
5.2.3 Biochemische Eigenschaften der Reinkultur des acetogenen Bakteriums T. phaeum bzw. der Kokultur
Synac .............................................................................................................................................. 57
5.2.4 Elektrophoretische Eigenschaften der Reinkultur T. phaeum, bzw. der Kokultur Synac ....................... 63
5.2.4.1 Eindimensionale Gelelektrophorese ............................................................................................ 63
5.2.4.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese .......................................................................................... 64
6 Diskussion .........................................................................................................................65
6.1 Diskussion: syntrophe Cadaverin-Oxidation durch eine methanogene Kokultur LC 13M......... 65
6.1.1 Isolierung einer Cadaverin-oxidierenden, methanogenen Kokultur .................................................... 65
6.1.2 Physiologie der methanogenen Kokultur LC 13M ............................................................................... 65
6.1.3 Biochemie der methanogenen Kokultur LC 13M ................................................................................ 66
6.1.4 Taxonomie der Reinkultur LC 13R ...................................................................................................... 71
6.2 Diskussion: syntrophe Acetat-Oxidation durch eine methanogene Kokultur Synac ................. 72
6.2.1 (Homo)-Acetogenese als spezielle Form der anaeroben Atmung mit CO2 als Elektronenakzeptor : der
reduktive Acetyl-CoA-Weg/Wood-Ljungdahl-Weg ........................................................................... 72
6.2.2 Energiekonservierung in acetogenen Bakterien ................................................................................. 74
6.2.2.1 Na+-abhängige Organismen ......................................................................................................... 75
6.2.2.2 H+-abhängige Organismen ........................................................................................................... 76
6.2.3 Einfluss von Na+ auf das Wachstum und die Produktbildung des acetogenen Bakteriums
Thermacetogenium phaeum ........................................................................................................... 78
6.2.4 Elektronentransfer zwischen den Partnern der methanogenen Kokultur Synac .................................. 80
6.2.5 Potentielle Mechanismen der Ausbildung eines transmembranen H+/Na+ -Gradienten während der
syntrophen Oxidation von Acetat durch die methanogene Kokultur Synac ...................................... 80
6.2.5.1 NADH-Dehydrogenase I (NDH-I) .................................................................................................. 82
6.2.5.2 NADH : Chinon Oxidoreduktase (NQR) ......................................................................................... 83
6.2.5.3 Rnf-Protein-Komplexe ................................................................................................................. 83
6.2.5.4 Elektronendismutierende Systeme .............................................................................................. 84
6.2.5.5 Ech (Energy converting hydrogenase)-Hydrogenasen ................................................................... 87
6.2.6 Potentielle - an der Energiekonservierung der Reinkultur - beteiligte Enzyme bzw. Enzymsysteme ... 89
6.2.7 Potentielle - an der Energiekonservierung der syntrophen Oxidation von Acetat - beteiligte Enzyme
bzw. Enzymsysteme ........................................................................................................................ 93
6.3 Ausblick ................................................................................................................................... 99
7 Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 100
1 Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde die anaerobe, syntrophe Oxidation der Fettsäure Acetat und des biogenen
Amins Cadaverin (1,5-Diaminopentan) durch zwei verschiedene definierte methanogene Kokulturen
untersucht.
Es sollte geklärt werden auf welche Weise die syntrophe thermophile Kokultur SynAc die Fettsäure
Acetat anaerob oxidiert. Dazu sollte das Acetat vergärende Bakterium Thermacetogenium phaeum
- einerseits in Reinkultur, andererseits syntroph gewachsen - auf das Vorhandensein der Schlüssel-
Enzyme des Wood-Ljungdahl Abbauweges untersucht werden. Unterschiede in der Enzymexpression
unter beiden Wachstumsbedingungen sollten biochemisch und proteomisch untersucht und
dargestellt werden. Die Proteine sollten bezüglich ihrer Lokalisation in den Kompartimenten in
cytoplasmatische, oder Membran-assoziierte, bzw. –integrierte Proteine eingeordnet werden.
Aufgrund dieser spezifischen Anordnung sollten Rückschlüsse auf die möglichen energieliefernden
Schritte des Acetatabbaus gezogen werden. Eine eventuelle Natriumabhängigkeit des acetogenen
Bakteriums T. phaeum sollte untersucht werden.
Die aus der Anreicherungskultur La Cad isolierte syntrophe mesophile Kokultur LC 13M sollte
physiologisch und phylogenetisch charakterisiert werden. Es sollte der Weg des Cadaverinabbaus
durch biochemische Methoden aufgeschlüsselt werden. Die sich dabei bildenden Produkte sollten
bestimmt und quantifiziert werden.
In beiden Projekten sollten die Enzyme identifiziert werden, die an der ATP-Synthese und an den
revertierten Elektronentransportsystemen beteiligt sind, bei welchen primär synthetisiertes ATP
reinvestiert werden muss .
1. Das gärende Bakterium T. phaeum in der thermophilen Kokultur SynAc verfügt über die
charakteristischen Enzyme des Wood-Ljungdahl Abbauweges und wäre somit in der Lage
Acetat zu oxidieren. Diese Reproduzierbarkeit der Enzymmessungen bestätigt unsere
bisherigen Untersuchungen.
2. Die Expression bzw. Lokalisation der untersuchten Enzyme unterscheidet sich bei der
Kultivierung von T. phaeum in Reinkultur versus syntroph gewachsener Zellen und
ermöglicht die Skizzierung eines hypothetischen Modells der Enzymanordung in T. phaeum.
3. Das scheinbare Vorhandensein von sog. Ech Hydrogenasen, einer mit einer Ech-Hydrogenase
assoziierten CO-Dehydrogenase, Rnf-Komplexen und eines NADH-Dehydrogenase I ähnlichen
Zusammenfassung 6

Enzyms, weisen auf eine eventuelle Beteiligung dieser Enzyme bei der Konservierung von
Energie hin.
4. Die Natriumabhängigkeit von T. phaeum in Reinkultur scheint abhängig von dem Substrat der
vorausgehenden Kultivierung zu sein. Bei Wachstum auf Methanol als Energiequelle scheint
das Vorhandensein von Na+ nicht notwendig zu sein. Im Gegensatz hierzu lässt sich - bei
vorausgegangener autotropher Kultivierung mit H /CO (80/20%) - ohne Natrium kein
2 2
Wachstum beobachten.
5. Es scheinen bei Kultivierung mit Pyruvat keine Cytochrome in der Membran von T. phaeum
vorhanden zu sein, die bei einem eventuellen Elektronentransport in der Membran eine
Rolle spielen könnten.
6. Die isolierte mesophile Kokultur LC 13M verwertet das biogene Amin Cadaverin (1,5-
Diaminopentan) anaerob als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. Als Zwischen- bzw.
Endprodukte wurden Acetat, Butyrat, Glutarat und Methan gefunden, welche qualitativ und
quantitativ bestimmt wurden. Bei Hemmung des methanogenen Partnerorganismus durch
BES konnte kein Wachstum der definierten KoKultur beobachtet werden.
7. Die Kultur LC 13M kann auf alternativen Substraten unter ähnlicher Produktbildung wachsen.
8. Das gärende Bakterium verfügt über eine Enzymausstattung, die einen Abbau des Cadaverins
nach dem skizzierten Abbauweg ermöglichen.
9. Ein revertierter Elektronentransport scheint nicht an das Vorhandensein eines speziellen
Konzeptes der Elektronendismutation (sog. „Buckel-Thauer“ Reaktion) und
dementsprechend nicht an die daran beteiligten Enzyme gekoppelt zu sein.
10. Der Cadaverin-oxidierende Partner konnte phylogenetisch eingeordnet werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass das acetogene Bakterium T. phaeum die
Fettsäure Acetat anaerob syntroph über den Wood-Ljungdahl-Weg oxidiert. Dieser Abbau scheint je
nach vorausgehender Kultivierung nicht an das Vorhandensein von Natrium gebunden zu sein.
Dementsprechend könnte es sich bei Thermacetogenium phaeum um ein H+-abhängiges, acetogenes
Bakterium handeln. Der Elektronentransfer scheint primär über Wasserstoff, aber auch in gewissem
Maße über Formiat stattzufinden. Die Lokalisation der beteiligten Enzyme lassen erste Rückschlüsse
auf die möglichen energiekonservierenden Schritte dieses Acetatabbaus zu. Jedoch müssen diese
Annahmen durch Proteomanalysen bestätigt werden. Es war möglich erste Unterschiede in den
Proteinmustern der cytoplasmatischen Fraktion mit Hilfe von 2D-Gelelektrophorese darzustellen.
Zusammenfassung 7

Diese Methode muss jedoch weiter optimiert werden, damit eine N-terminale Sequenzierung der
betreffenden Proteine durchgeführt werden kann.
Weiterhin deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die definierte, methanogene Kokultur
LC 13 M das biogene Amin Cadaverin (1,5-Diaminopentan) nach einem hier skizzierten
hypothetischen Abbauweg anaerob oxidiert und das Substrat somit als alleinige Kohlenstoff- und
Energiequelle nutzen kann. Der anaerobe Abbau von Cadaverin ist an eine syntrophe Partnerschaft
mit einem methanogenen Partnerorganismus gekoppelt, wobei der Elektronenaustausch über
Wasserstoff und nicht über Formiat zu erfolgen scheint. Der revertierte Elektronentransport scheint
nicht mit Hilfe der an der „Buckel-Thauer“ Reaktion beteiligten Enzyme zu erfolgen. Die NADH-
oxidierenden Enzyme müssen lokalisiert und identifiziert werden, um eine Aussage hinsichtlich ihrer
Beteiligung am revertierten Elektronentransport treffen zu können.
2 Abkürzungsverzeichnis
Acetyl-CoA Acetyl-Coenzym A
ACS Acetyl-CoA-Synthase
ACMA 9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridin
ADP Adenosindiphosphat
AMP Adeninmonophosphat
APAD+ 3-Acetylpyridin adenine dinukleotid oxidierte Form
ATP Adenosintriphosphat
-KG alpha-Ketoglutarat
bidest. bidestilliert
BES 2-Bromethansulfonsäure
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp Base pair (Basenpaar)
BV Benzylviologen (1,1’-Dibenzyl-4,4-bipyridinium)
ox./red.
oxidierte/reduzierte Form
C Konzentration
CoA-SH Coenzym A
D Schichtdicke der Küvette
Da Dalton
DCCD N,W-Dicyclohexylcarbodiimid
DH Dehydrogenase
DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
DTE Dithioerythritol
DTT Dithiothreitol
 Extinktion
EC Kennnummer der Enzyme Nomenclature des
Nomenclature Comittee der International Union
Abkürzungsverzeichnis 9

of Biochemistry and Molecular Biology (1992)
 molarer Extinktionskoeffizient
 Extinktionsänderung
EDTA Ethylendiamintetraacetat
FAD Flavinadenosindinukleotid oxidierte Form
Fd Ferredoxin oxidierte/reduzierte Form
ox./red.
FID Flammenionisationsdetektor
GC Gaschromatographie
HCl Chlorwasserstoffsäure
HPLC High Performance Liquid Chromatography
(Hochdruck-Flüssig-Chromatographie)
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
INT 2-[4-iodophenyl]-. 3-[4-nitrophenyl]-5- phenyltetrazolium
Chloride
K [Fe(CN) ] Kaliumhexacyanidoferrat(III)
3 6
LDH Laktatdehydrogenase
MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonsäure
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
MV Methylviologen oxidierte/reduzierte Form
ox./red.
NAD+ Nikotinsäureamidadenosindinukleotid oxidierte Form
NADH/H+ Nikotinsäureamidadenosindinukleinsäure reduzierte Form
NBT Nitrotetrazoliumblau
OD „Optische Dichte“ einer Bakteriensuspension

bei der Wellenlänge

PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PEP Phosphoenolpyruvat
RNS Ribonukleinsäure
SDS Natriumdodecylsulfat
Rpm Rounds per minute (Umdrehungen in der Minute)
T Zeit
Abkürzungsverzeichnis 10

TBE Tris-Borat-EDTA
TCA Trichloressigsäure
TEA Triethanolamin
THF Tetrahydrofolat
Tris Tris (hydroxymethyl)-Aminomethan
TTC 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid
U Units
V Volumen
Y molarer Wachstumsertrag
m
Y Energieertragskoeffizient
ATP
% (v/v) Volumenprozent
% (w/v) Gewichtprozent