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LAB 0 RMANUAL
Springer-Verlag Berlin Heidelberg GmbH
Werner A. Eckert Jürgen Kartenbeck
Proteine:
Standard methoden
der Molekular-
und Zellbiologie
Präparation, Gelelektrophorese,
Membrantransfer
und Immundetektion
Mit 53 Abbildungen
Springer
Professor Dr. WERNER A. ECKERT
Labor Dr. Riegel & Partner
Abt. Molekulargenetische Diagnostik
Kreuzberger Ring 60
D-65205 Wiesbaden
PD Dr. JURGEN KARTENBECK
Deutsches Krebsforschungszentrum
Abteilung fur Zellbiologie
Im Neuenheimer Feld 280
D-69120 Heidelberg
Die Deutsche Bibliothek -CIP-Einheitsaufnahme
Eckert, Werner A.:
Proteine: Standardmethoden der MolekuIar-und Zellbiologie : Prăparation,
Gelelektrophorese, Membrantransfer und Immundetektion / Werner A. Eckert ;
Jiirgen Kartenbeck -Berlin; Heidelberg ; New York; Barcelona ; Budapest ;
Hongkong; London ; Mailand ; Paris; Santa Clara; Singapur ; Tokio ;
Springer, 1997
ISBN 978-3-642-47759-1 ISBN 978-3-642-59227-0 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-642-59227-0
NE: Kartenbeck, Jiirgen
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© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1997
Urspriinglich erschienen bei Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York 1997
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SPIN 10041888 39/3137-5 4 3 2 1 0-Gedruckt auf saurefreiem Papier
GELEITWORT
Das vorliegende Methodenbuch für den Praktiker ist eine Antwort auf
die im Laboralltag häufig gestellte Frage: Wo kann man denn das mal
genau nachlesen - und möglichst auf deutsch? Für das biochemische,
zellbiologische und molekularbiologische Arbeiten mit Proteinen liegt
nun endlich eine praktische Arbeitsanleitung vor - dank der so akribi
schen wie kritischen Arbeit der Autoren, die nicht nur die einzelnen Ar
beitsschritte in der übersichtlichen Form eines "Kochbuches" zusam
mengestellt haben, sondern die Reproduzierbarkeit selbst noch einmal
experimentell überprüft haben. Dem Buch ist zu wünschen, daß es eine
weite Verbreitung findet und damit möglichst vielen jungen Wissen
schaftlern hilft, bei ihren experimentellen Arbeiten optimale Ergebnisse
zu erzielen.
Heidelberg, Werner W. Franke
September 1996
VORWORT
Der Plan, gängige Methoden der Präparation, der elektrophoretischen
Auftrennung und der anschließenden immunchemischen Identifizie
rung von Proteinen zusammenzufassen, entstand ursprünglich wäh
rend eines wissenschaftlichen Gastaufenthaltes einer der Autoren
(W.A.E.) am Institut für Zellbiologie im Deutschen Krebsforschungs
zentrum (DKFZ) Heidelberg. Angesichts der Vielzahl verschiedener
spezieller Techniken, um Proteine aus Zellen und Geweben zu isolieren
und zu charakterisieren, die überdies in unzähligen Modifikationen
und Laborvarianten vorkommen und in der Fachliteratur verstreut
sind, erschien es sinnvoll, ja geradezu notwendig, die grundlegenden
Methoden, die in der Zell- und Molekularbiologie, in der Tumorfor
schung und medizinischen Diagnostik seit Jahren erfolgreich eingesetzt
werden, in einem deutschsprachigen Methodenbuch zusammenzufas
sen. Die einzelnen Methoden sollten dabei so ausführlich dargestellt
werden, daß sie auch ohne spezielle Vorkenntnisse durchgeführt wer
den können. Dieses ursprüngliche Konzept "aus der Praxis für die Pra
xis" ist von den Autoren beibehalten worden, trotz der zwischenzeitli
chen technischen Weiterentwicklung und der damit verbundenen
beträchtlichen Ausweitung der zu beschreibenden Einzelmethoden. So
wendet sich das Buch sowohl an Mediziner, die neben ihrer Klinikarbeit
diese Methoden in der Forschung einsetzen möchten, als auch an Dok
toranden, wissenschaftliche und technische Mitarbeiter und Studenten
in biomedizinischen Forschungsbereichen, die noch wenig Erfahrung
in der biochemischen Laborarbeit haben.
Zum Aufbau und Gebrauch des Buches ist folgendes zu bemerken:
Der gesamte Stoff ist in 4 Hauptteile gegliedert, die dem Untertitel des
Buches entsprechen: Präparation, Auftrennung durch Gelelektrophore
se, Transfer aus Polyacrylamidgelen auf Trägermembranen und Nach
weis von Proteinen auf Blot-Membranen mit verschiedenen immun
chemischen Methoden. Die einzelnen Methoden bzw. Versuchseinhei
ten sind in Unterkapiteln (zwei- oder dreistellige Hierarchie) beschrie
ben, wobei diese nach dem Konzept der Springer Labormanuale in
VIII
Abschnitte gegliedert sind, die den jeweiligen Arbeitsabläufen entspre
chen.
Jeder Methode oder Methodengruppe vorangestellt ist eine Einlei
tung, die einen Überblick über den theoretischen Hintergrund, die An
wendungsmöglichkeiten und die Empfindlichkeit der jeweiligen Tech
nik sowie Literaturhinweise gibt. Über das theoretische Verständnis
hinaus soll der Benutzer auch in die Lage versetzt werden, die beschrie
benen Methoden für seine speziellen Bedürfnisse und wissenschaftli
chen Problemstellungen zu modifizieren und die Ergebnisse methoden
kritisch zu interpretieren. Bei komplexen Methoden oder Arbeits
abläufen folgt der Einleitung eine Verlaufsübersicht als Flußdiagramm.
Bei den Materialien sind sämtlich Chemikalien, Reagentien und Gerät
schaften aufgelistet, die zur Durchführung der jeweiligen Methode not
wendig sind. Zum Teil sind Bezugsquellen angegeben, die sich aus der
Erfahrung der Autoren ergaben. Dies schließt jedoch nicht aus, daß
auch ähnliche Produkte anderer Firmen mit vergleichbarem Erfolg ver
wendet werden können. Ein umfangreiches Bezugsquellenverzeichnis
für die im Buch häufig erwähnten Materialien befindet sich im Anhang.
Die Durchführung der einzelnen Methoden ist in detaillierten Schritt
für-Schritt-Protokollen dargestellt, so daß auch für Erstanwender mit
wenig praktischer Laborerfahrung ein problemloses Nacharbeiten
möglich ist. Alle Methoden sind von den Autoren bzw. von Kollegen in
benachbarten Labors praktisch erprobt worden. Ratschläge und Erklä
rungen zu den einzelnen Arbeitsschritten sind im Text kursiv gehalten.
Hinweise zu Lagerbedingungen, zu toxischen und anderen gefährlichen
Eigenschaften von Substanzen, auf mögliche ModifIkationen der be
schriebenen Methoden und gegebenen auf weiterführende Spezialme
thoden sind in einem gesonderten Abschnitt bei den jeweiligen Kapiteln
aufgeführt. Eine Fehlersuche am Ende einiger Kapitel soll es dem An
wender ermöglichen, Fehlerquellen bei der Durchführung von komple
xen Methoden aufzufinden und zu beseitigen.
Wir möchten allen Kollegen danken, die durch Anregungen, Über
lassung von Originalabbildungen sowie konstruktive Kritik nach
Durchsehen des Manuskriptes maßgeblich zur endgültigen Form des
vorliegenden Methodenbuches beigetragen haben. Unser spezieller
Dank gilt Prof. Dr. W. W. Franke, PD Dr. J. Kleinschmidt, Dr. M. Dem
lehner, S. Winter (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg),
Prof. Dr. Dr. A. Völkl (Institut für Anatomie, Universität Heidelberg)
sowie Dr. L. Konrad (Institut für Anatomie und Zellbiologie, Universi
tät Marburg).
IX
Nicht zuletzt ganz herzlich bedanken mächten wir uns bei Frau E.
Ouis für das Schreiben des Textes sowie bei Frau Dr. J. Lindenborn vom
Springer-Verlag für Ihre Vorschläge zur Gestaltung und Gliederung des
Stoffes und Ihre Geduld bis zur Fertigstellung des Manuskriptes.
Heidelberg, Werner A. Eckert
September 1996 Jürgen Kartenbeck
Inhaltsverzeichnis
1 Präparation von Proteinen für die Gelelektrophorese.......... 1
1.1 Allgemeine Einleitung und Überblick ..................................... 1
1.2 Radioaktive Markierung von Proteinen
in wachsenden Kulturzellen...................................................... 3
1.3 Zell-Lyse und differentielle Extraktion von Proteinen .......... 6
1.4 Isolierung von Intermediärfilament-Proteinen
aus Zellkulturen und verschiedenen Geweben ....................... 13
1.4.1 Allgemeine Einleitung und Überblick ................. 00.................. 13
1.4.2 Isolierung von Intermediärfilamenten aus Kulturzellen
durch Extraktion mit Puffern hoher Salzkonzentration........ 16
1.4.3 Isolierung von Intermediärfilamenten aus Kulturzellen
unter Benutzung von DNAse .................................................... 17
1.4.4 Isolierung von Intermediärfilament- Proteinen
aus verschiedenen Geweben ..................................................... 19
1.4.5 Isolierung von Intermediärfilament-Proteinen
vom Cytokeratintyp und Desmosomen
aus mehrschichtigem verhorntem Epithel.............................. 21
1.5 Isolierung von Gesamtprotein und RNA aus Kulturzellen
und Geweben .............................................................................. 24
1.5.1 GTC-CsCL-Ultrazentrifugationsmethode ............................... 24
1.5.2 Schnellmethode nach Chomczynski ........................................ 31
1.6 Synthese und radioaktive Markierung von Proteinen
durch in vitro Translation von messenger RNA..................... 35
1.7 Anreicherung spezifischer Proteine aus Zellextrakten
oder aus in vitro Translationsansätzen
durch Immunpräzipitation....................................................... 41
1.8 Fällung von Proteinen durch organische LösungsmitteL..... 49
XII Inhaltsverzeichnis
1.8.1 Einleitung ................................................................................... 49
1.8.2 Acetonfällung............................................................................. 50
1.8.3 Fällung mit Chloroform-Methanol.......................................... 51
1.9 Reinigung und Konzentrierung von Proteinlösungen........... 52
1.9.1 Allgemeine Einleitung und Überblick ..................................... 52
1.9.2 Dialyse......................................................................................... 53
1.9.3 Ultrafiltration mit dem Konzentratorsystem Centricon ....... 56
1.9.4 Vakuumdialyse mit Kollodiumhülsen..................................... 58
1.9.5 Konzentrieren und Trocknen in einer
Vakuum-Konzentrations-Zentrifuge (Speed Vac System) ... 59
1.9.6 Lyophilisierung (Gefriertrocknung) ........................................ 61
1.10 Quantitative Bestimmung von Proteinen................................ 62
2 Auftrennung von Proteinen durch Elektrophorese
in Polyacrylamidgelen .............................................................. 67
2.1 Kurze Einführung in die elektrophoretischen Eigenschaften
von Proteinen und die Struktur von Polyacrylamidgelen ..... 67
2.2 Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ....... 71
2.3 Zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese ............. 93
2.4 Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen ...................... 111
2.4.1 Allgemeine Einleitung und Überblick ..................................... 111
2.4.2 Färbung mit Coomassie Brilliantblau-Farbstoffen ................ 112
2.4.3 Färbung durch Silberimprägnierung ....................................... 118
2.5 Fehlersuche ................................................................................ 126
2.6 Dokumentation und Auswertung
von 1D-und 2D-PAGE-Proteinauftrennungen ...................... 128
2.6.1 Photo graphie von gefärbten Gelen .......................................... 129
2.6.2 Bestimmung von Molekulargewichten
und isoelektrischen Punkten .................................................... 129
2.6.3 Densitometrie ............................................................................. 132
2.7 Elution von Proteinen aus Polyacrylamidgelen ...................... 134
2.7.1 Allgemeine Einleitung und Überblick ..................................... 134
2.7.2 Elektrophoretische Elution ....................................................... 135
2.7.3 Elution durch Diffusion ............................................................ 139
2.8 Konservierung von gefärbten Polyacrylamidgelen
durch Trocknung zwischen Zellophanfolien .......................... 140
