Producción de proteasas fúngicas por fermentación en estado sólido para su aplicación en la ...

227 Pages·2012·2.52 MB·Spanish

Tesis de Posgrado
PPrroodduucccciióónn ddee pprrootteeaassaass ffúúnnggiiccaass
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ddee aalliimmeennttooss
Sanchez, Virginia E.
1999
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Químicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
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Cita tipo APA:
Sanchez, Virginia E.. (1999). Producción de proteasas fúngicas por fermentación en estado
sólido para su aplicación en la industria de alimentos. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires.
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Cita tipo Chicago:
Sanchez, Virginia E.. "Producción de proteasas fúngicas por fermentación en estado sólido para
su aplicación en la industria de alimentos". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1999.
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Universidad de Buenos Aires
Facultad de CienciasExactas y Naturales
Departamento de Industrias
Producciónde proteasas fúngicas
por fermentación en estado sólido
para su aplicaciónen la industria de alimentos
Autor: Lic. Virginia E. Sanchez
Director: Dra. Ana MR. Pilosof
Tesispara optar al titulode
Doctorde la Unibersidad de Buenos Aires
1999
Universidad de Buenos Aires
Facultad de CienciasExactas y Naturales
Departamento de Industrias
Fungal protease production
for food application,
by solid state fermentation
Author: Lic. VirginiaE. Sanchez
Director:Dra. Ana MR. Pilosof
Doctoral Thesis
Universidad de Buenos Aires
1999
RESUMEN
Producción de proteasas fúngicas por fermentación en estadosólidopara su
aplicación en la industria de alimentos
Se evaluó la utilización de la fermentación en estado sólido para producción de
proteasas por Aspergillus. A través de una selección entre 210 cepas sobre placas de
agar leche en condiciones relevantes para la FES, se seleccionó a Aspergillus niger 91
como la más adecuada para estudios futuros.
Se ensayó el efecto de diferentes sustratos naturales. La mejor producción de proteasa se
obtuvo por fermentación de una mezcla de soja : afrechillo de arroz (7:3), con una
relación carbohidrato/proteína de 0,8 y una proporción reducida de partículas de soja
superiores a 3,35 mm. La adición de carbohidratos y fuentes de nitrógeno y proteína no
tuvo efecto significativo.
Se realizó un estudio cinético de la FES evaluando el efecto de parámetros ambientales
(contenido de agua inicial - actividad de agua, pH y temperatura). La proteasa producida
mostró un modelo mixto, de asociación parcial al crecimiento; se describió la cinética
de producción de biomasa, consumo de sustrato, proteasa y conidios con una ecuación
logística. En las condiciones óptimas (40% Ho, Aw0,969, pHo 6, 37°C), Aspergillus
niger 91 produjo 10000UP/g SSo(15800 UP/g msk), siendo esto varias veces superior a
otros sistemas de fermentación.La relación lineal encontrada entre la pérdida de peso
seco y tanto la biomasa como la proteasa facilita la estimación de éstas a través de un
parámetro facilmente medible.
Se encontró una correlación entre la producción de proteasa y conidios y su asociación
con un patrón común en laevolución del pH.
Debido a la secreción diferencial de dos proteasas al medio se observaron variaciones en
la actividad proteolítica y la estabilidad térmica de los extractos enzimáticos de acuerdo
al tiempo de fermentación.
Palabras clave: fermentaciónen estado sólido, proteasa,
Aspergillus niger, cinética, conidio.
ABSTRACT
Fungal protease production for foodapplication, bysolidstate fermentation
The feasibility of using solid state ferrnentation for the production of protease by
Aspergillus fungi was evaluated. Aspergillus niger 91 was selected as being the most
suitable for future studies, by screening among 210 strains on milk agar plates under
relevant conditions forsolid state fermentation.
The effect of different natural substrates was tested. The best was obtained by
fermenting a soybean : rice bran mixture (7:3), with a carbohidrate/protein around 0,8
and a reduced proportion of soybean particle size bigger than 3,35 mm. The addition of
carbohidratos, nitrogen and protein sources had no significant influence on the protease
yield.
A kinetic study of solid state ferrnentation was conducted evaluating the effect of
environmental parameters (initial water content - water activity, pH and temperature).
The protease formed exhibited a mixed - growth associated pattem, and biomass,
substrate consumption, protease and conidial kinetics were described with a logistic
equation. At optima] conditions (40% Ho,Aw0,969, pHo6, 37°C), Aspergillus niger 9l
produced 10000 PU/g SSo (15800 PU/g dwk), several times higher than other
ferrnentation systems. A linear relationship was found between the dry matter weight
loss and both biomass and protease production allowing their estimation through an
easily measurable parameter.
A correlation between protease and conidial production and its connection with a pH
evolution common pattem was described.
Due to differencial secretion of two proteases, variations in the proteolitic activity
pattem and different thermal properties of ferrnentation extracts were found during
fungal growth.
Key words: solid state fennentation, protease,Aspergillus niger, kinetic, conidia.
A mispadres
Agradecimientos
A Ana Pilosof por su guia y colaboración en el desarrollo de esta Tesis, por su
honestidad, afecto personal y la libertad que genera en su grupo de trabajo. Yen
particular enmislargosy dificilestiemposdeescritura por sutolerancia y respeto.
A Marta Huergo por permitirme un lugar de aprendizaje en el Laboratorio de
Microbiologia ypor suafecto e interés durante estosaños.
A mis compañeros de los Laboratorios de Microbiologia Industrial, Tecnologia de
Alimentos y PlNMATE.'
Mauricio Terebiznik,Patricia Cerrutti, Patricia Lodato, Lucas González, Maria Elena
Chaparro, Maria del Carmen Castro, Silvia Peschiera, Sara lpiña, Teresa Bocca,
VivianaTaragano, Dina Carp, Nora Bombara, VanesaZylberman, Rosa Baeza, Beatriz
Elizalde, Pilar Buera, Carolina Schebor, Leila Burin, Florencia Mazzobre, Silvia
Cardona, Mónica Haros, Ana Rojas, Pablo Bonelli
Por la interacción intelectualy personal que nospermite crecer, por la colaboración
espontánea, por los buenos (y no tanto) momentos compartidos, y por los empujones
recibidos en los últimos tiempos.
A Maria Delia, Elvira, Miriam, Maria Elena, Nelly, Esmilda y Olga, porque cada una
desdesu lugar hace la vidaenestepabellón másagradable.
AlCONICETy la UBApor las becasy subsidios otorgados.
A Alejandro, Gladys, Carina, Sofia y Cleo, por soportar mis tenebrosos tiempos de
ignorancia informática, por las alegrías y tristezas vividas, por la compañia
permanente,por unfuturo mejorpara todos.
Al resto de mifamilia y mis amigos de siempre, porque no importan los tiempos, las
distancias ni loscaminoselegidospara seguir compartiéndonos.
ÍNDICE
Indice
INTRODUCCIÓN
1. FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO
1.1.Caracteristicas generales de IaFES
1.2.Historia.aplicaciones actuales yperspectivas
1.3.Variables de proceso en FES
2. PROTEASAS
2.1. Origenes yperspectiva actual
2.2. Clasificaciónypropiedades
2.2.1. Serin proteasas
2.2.2. Cisteinproteasas
2.2.3. Métaloproteasas
2.2.4. Aspárticoproteasas
2.3. Funciones
2.4. Métodos de producción
2.4.1. Fermentación en Estado Sólido
2.4.2. Fermentación sumergida
2.5. Aplicaciones industriales
2.5.1. Detergentes
2.5.2. Cueros
2.5.3. Alimentos yBebidas
3.ASPERGILLUS: DOMINIOACTUALYPERSPECTIVAS FUTURAS
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
.SELECCIÓN DECEPAS PROTEOLITICAS
—l
1.1.Aislamiento de hongos
1.2.Screening primario
1.3.Screening secundario
1.3.1. Efectode latemperatura
1.3.2. Efecto de laglucosa
1.3.3. Efecto de Iaactividad de agua
1.4. Identificacióntaxonómica de Iacepa 91 aislada
N FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO
2.1. Sistema de fermentación
2.2. Inóculoypreservación de las cepas
2.3. Sustrato
2.4. Contenido de agua (H%)
2.5. Peso húmedo ypeso seco
2.6. Actividad de agua (Aw)
2.7. Isoterma de sorción delsustrato sojarafrechillode arroz
.pHinicialdel sustrato yseguimiento del pHdurante lafermentación
. .Obtención del extracto crudo de fermentación
2NN.1(DC)0. Adiciónde diferentes metabolitos alsustrato inicial
2.10.1. Fuentes de carbono
2.10.2. Fuentes de nitrógeno
2.10.3. Fuentes externas de proteina
2.10.4. Clorurode sodio
2.11. Estimación de biomasa fúngica
2.11.1. Determinaciónde glucosamina
2.11.2. Determinacióndelfactorde conversión de glucosamina a biomasa
Indice
2.12. Recuento de conidios 56
2.13. Fermentación en medio liquido 56
3. DETERMINACION DEACTIVIDADES ENZIMATICAS
3.1. Proteasa ácida
3.1.1. Método de Tsujita yEndo (1976) modificado
3.1.2. Metodo de Anson (1938) modificado
3.2. Glucoamilasa
4. DETERMINACIÓNDEOTROS METABOLITOSen el extracto de fermentación
4.1. Proteinas
4.2.Azúcares reductores
4.3. Glucosa
.CARACTERIZACION YPURIFICACIÓN PARCIALDELEXTRACTO PROTEOLÍTICO
U1
5.1. Caracterización del extracto crudo por Iavariación de su actividad
5.1.1. Actividada distintas temperaturas
5.1.2. Actividadresidual a diferentes temperaturas
5.1.3. Actividad a distintos pH
5.1.4. Actividad residual a distintos pH
5.2. Calorimetrla diferencial de barrido (DSC)
5.3. Ultrafiltración
5.4. Cromatografía de intercambioaniónico
5.5. Cromatografía de filtraciónmolecular
5.6. Electroforesis en geles de poliacrilamida
6. TRATAMIENTO DE DATOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CAPÍTULO 1
Selección e identificación de una cepa
para producción deproteasas enFES
1.SELECCION DE UNACEPA PARAPRODUCCION DE PROTEASAS EN FES
1.1.Selección primariasobre placas de agar leche
1.2.Selección secundaria
1.2.1. Efecto de Iatemperatura
1.2.2. Efecto de laglucosa
1.2.3. Efecto de laactividad de agua
1.3.Selección finalen FES del microorganismo adecuado
2. IDENTIFICACION TAXONOMICA DE LACEPA 91
CAPÍTULOII
Seleccióndel sustratopara la FES
1. ELECCION YCARACTERIZACION DELSUSTRATO
1.1. Efecto del tipode sustrato
1.2. Efecto deltamaño de partlcula delsustrato
1.3. Isoterma de sorción del sustrato sojazafrechillode arroz (7:3)
1.4. Efecto del modo de cultivo