Praca doktorska Rozwój specjalizowanych układów scalonych oraz technik analizy danych do ...

145 Pages·2014·12.33 MB·English

AKADEMIA GÓRNICZO-HUTNICZA IM. STANISŁAWA STASZICA W KRAKOWIE
Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej

Praca doktorska

mgr inż. Przemysław Rydygier

Rozwój specjalizowanych układów
scalonych oraz technik analizy danych do
badań żywych sieci neuronowych z
wykorzystaniem matryc mikroelektrod

Promotor: prof. dr hab. inż. Władysław Dąbrowski

Kraków 2014
2
Oświadczenie autora rozprawy:
Oświadczam, świadomy odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że
niniejszą pracę doktorską wykonałem osobiście i samodzielnie i że nie korzystałem ze
źródeł innych niż wymienione w pracy.

data, podpis autora
Oświadczenie promotora rozprawy:
Niniejsza rozprawa jest gotowa do oceny przez recenzentów.

data, podpis promotora rozprawy
3
Rozprawa doktorska przygotowywana była w :
Zespół Elektroniki Jądrowej i Detekcji Promieniowania
Zakład Oddziaływań i Detekcji Cząstek
Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej AGH w Krakowie
The Santa Cruz Institute for Particle Physics
University of California, Santa Cruz

Podziękowania:

Pragnę złożyć podziękowania Polsko-Amerykańskiej Komisji Fulbrighta za przyznanie
stypendium wyjazdowego „Fulbright Junior Advanced Research Award”, które umożliwiło
mi uczestniczenie w eksperymentach badawczych w Stanach Zjednoczonych, bez których
ta praca doktorska nie mogłaby powstać, a także Ministerstwu Nauki i Szkolnictwa
Wyższego za finansowanie prac badawczych w ramach grantu Nr N N515 335736 „Rozwój
specjalizowanych układów scalonych o małym poborze mocy do wielokanałowej stymulacji
elektrycznej i rejestracji sygnałów z komórek nerwowych w eksperymentach in-vivo”

Pragnę podziękować wszystkim, bez których ta praca doktorska nie mogłaby powstać,
przede wszystkim mojemu promotorowi Panu Profesorowi Władysławowi
Dąbrowskiemu za ukierunkowanie naukowe pracy oraz udzieloną pomoc, oraz Panu
Profesorowi Alanowi Litke za wprowadzenie w zagadnienia badań neurobiologicznych
oraz opiekę naukową podczas stażu w Uniwersytecie Kalifornijskim w Santa Cruz.

Szczególne podziękowania dla mojej żony Marzeny za cierpliwość, pomoc oraz wsparcie.

4
SUMMARY

The main subjects of the Dissertation are: development of application specific
integrated circuits for simultaneous electrical stimulation and recording from neural
cells using microelectrode arrays and development of methods for automated
recognition of functional connectivity in live neural networks.
First chapter describes biological and physical fundamentals of electrical
phenomena in neural systems: neuron structure, initiation and propagation of the
action potential, neuron types, synapse structure and its properties, electrical model of
the synapse. A brief review of mouse brain anatomy is presented, focusing on
hippocampal structure and propagation paths of neural activities.
Second chapter presents state-of-the-art techniques of neural signals recording
based on microelectrode arrays. Various types of microelectrodes, needles and silicon
probes in context of extracellular recording are presented. Description of
512 electrode system for recoding spontaneous and evoked activity in vitro is
presented. Although presented system, developed in Department of Particle
Interaction and Detection Techniques WFiIS AGH, has been used successfully for many
years in neurobiological experiments, it has some limitations, namely bandwidth of the
recording circuitry not does not cover the frequency spectrum of the Local Field
Potentials (LFPs). Requirements for a new recording/stimulating integrated circuit are
presented to overcome limitations of the currently used system.
A design of new integrated circuit comprising both, readout and electrical
stimulation functionality, is presented in third chapter. The chip comprises readout
front-end recording circuits, stimulation circuits with digital-to-analog converter, and
an analog multiplexer. Details of circuit architecture, advantages and limitations, as
well as electrical tests results are discussed. Presented chip is foreseen for both, in
vitro as well as in vivo systems, for recording neural signals.
Development of the recording techniques must be accompanied by data analysis.
An introduction to statistical analysis of spontaneous neural activity recorded during
long (over 10 hours) experiments on brain slices is presented in forth chapter.
Preparation techniques, various approaches to data analysis, direction-sensitive and
insensitive methods are discussed briefly. The main focus has been put on cross-
correlation of two neurons activity as the method allowing to extract maximum
information from recorded activity. Cross-correlation of activity of neuron pairs allows
us to detect functional connections between correlated neurons. It also carries
information about connection type, direction, synapse type and synapse dynamics.
Cross-correlation method has been employed as basis of the algorithm developed for
automated recognition of functional connections between pairs of neurons.
The algorithm of finding functional connectivity has been applied to data recorded
during 52 experiments on cultured brain slices, which took place in Santa Cruz
Institute for Particle Physics. The results are described and discussed in the last
5
chapter. The subject of the experiments was strain Black 6 mouse brain hippocampal
structure. Results of functional connectivity of excitatory and inhibitory connections,
superimposed on slices’ photographs are presented. Also a method based on wavelet
transform for gamma rhythm synchronized pairs of neurons detection is presented.
Regarding development of the electronic circuits the goal of this dissertation was
to design a an integrated circuit capable of recording wide spectrum of neurobiological
signals (Spike Potentials and Local Field Potentials) and stimulating single neurons. To
address the first issue, a recording electronics has been designed. Single channel
comprises a preamplifier, followed by two parallel band-pass filters (500 Hz - 2 kHz
band for Spikes and 1 Hz – 300 Hz for LFPs), and two output amplifiers. 64 channels
are integrated in a single chip including also an analog multiplexer. A novel
multiplexing scheme has been elaborated and implement in the design resulting in
reduction of the clocking signal feed-through and significant improvement of
multiplexing precision at multiplexing frequency of 2.5 MHz.
Low power, 20 kHz, 9-bit, digital to analogue converter (DAC) has been designed to
be employed as stimulation pulse generator. To achieve balance between many
contradictory requirements, successive charge sharing architecture has been chosen.
The DAC is equipped with analogue memory cell and voltage buffer, controlled by
digital circuit to minimize digital signals feed-through. Low Differential Non-Linearity
(below 0.5 LSB) and Integral Non-Linearity (below 2 LSB) makes the signal generator
suitable for the purpose of electrical stimulation of neurons.
A novel method for finding functional connectivity between pairs of neurons, many
times more computationally effective compared to currently used spike jittering has
been proposed. Wavelet transform has been employed to detect pairs of neurons
spiking synchronously with frequency in a range typical for gamma rhythm
(30 - 70 Hz). Recordings from 52 experiments on cultured hippocampal slices were
analyzed in search for excitatory, inhibitory and gamma rhythm. 18 out of 52 slices
were extracted from genetically altered Fragile X mice. No statistical differences in
terms of functional connectivity density between Wild-type and Fragile X have been
identified.
Neural connectivity maps with neurons’ locations and functional connections,
superimposed on Day In vitro 1 photographs show good coherence with data found in
the literature in terms of excitation propagation paths between different regions of the
hippocampal structure. Detailed analysis of cross correlograms’ shapes proves that it
is possible to extract information about synaptic dynamics and synapse type from
extracellular recordings.

6
SPIS TREŚCI
Wstęp ........................................................................................................................................................................ 10
1. Geneza potencjałów czynnościowych w komórkach nerwowych. Rozkład
potencjału wokół komórki nerwowej w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków. ...... 12
1.1. Budowa i działanie komórki nerwowej. ........................................................................................12
1.1.1. Budowa komórki nerwowej ....................................................................................................... 12
1.1.2. Powstawanie i przewodzenie potencjału czynnościowego .......................................... 13
1.1.3. Propagacja potencjału czynnościowego wzdłuż aksonu ............................................... 15
1.2. Synapsa jako podstawowa jednostka organizacji żywych sieci neuronowych .............17
1.2.1. Budowa i rodzaje synaps ............................................................................................................. 17
1.2.2. Model elektryczny synapsy chemicznej ................................................................................ 19
1.3. Budowa mózgu myszy ze szczególnym uwzględnieniem hipokampa. .............................21
1.3.1. Budowa mózgu myszy .................................................................................................................. 21
1.3.2. Hipokamp – budowa morfologiczna i występujące w nim typy neuronów ........... 22
1.3.3. Interneurony i ich rola w działaniu hipokampa ................................................................ 24
1.3.4. Budowa hipokampa a połączenia funkcjonalne z innymi obszarami mózgu ........ 25
1.4. Obrazowanie elektrofizjologiczne, pole potencjału wokół komórki nerwowej. ..........26
2. Systemy do rejestracji aktywności elektrycznej kultur neuronowych
wykorzystujące matryce mikroelektrod .............................................................................................. 28
2.1. Rola matryc mikroelektrod w rejestracji aktywności komórek nerwowych.
Rejestracja wewnątrz i zewnątrzkomórkowa ............................................................................28
2.2. Sondy elektrodowe i mikroigły - najnowsze metody rejestracji potencjałów
zewnątrzkomórkowych .......................................................................................................................30
2.3. Budowa systemu 512-elektrodowego do rejestracji aktywności elektrycznej
żywych sieci neuronowych .................................................................................................................32
2.4. Wymagania projektowe dla nowego układu scalonego do równoczesnej
stymulacji i odczytu aktywności komórek nerwowych w eksperymentach
In-vitro oraz In-vivo...............................................................................................................................35
2.4.1. Dyskusja i założenia projektowe poszczególnych bloków funkcjonalnych ........... 35
1.1.1. Schemat blokowy układu scalonego NEUROSTIM. Odczyt / generowanie
sygnałów analogowych ................................................................................................................ 39
1.1.2. Interfejs komunikacyjny .............................................................................................................. 40
3. Projekt i testy wybranych bloków funkcjonalnych specjalizowanego układu
scalonego NEUROSTIM ................................................................................................................................ 41
3.1. Przetwornik cyfrowo-analogowy w układzie do stymulacji elektrycznej ......................41
3.1.1. Architektura przetwornika cyfrowo-analogowego .......................................................... 42
3.1.2. Ograniczenia architektury i źródła nieliniowości przetwornika ................................ 43
7
3.1.3. Pamięć analogowa i układ redukcji pasożytniczego wstrzykiwania ładunku ...... 46
3.1.4. Wyniki pomiarów przetwornika cyfrowo-analogowego .............................................. 48
3.2. Układ do rejestracji sygnałów neurobiologicznych ................................................................. 52
3.2.1. Filtr wejściowy i przedwzmacniacz ....................................................................................... 53
3.2.2. Filtry pasmowo-przepustowe .................................................................................................. 54
3.2.3. Wzmacniacze wyjściowe ............................................................................................................ 57
3.2.4. Wyniki pomiarów charakterystyk częstotliwościowych i liniowości ...................... 58
3.3. Multiplekser analogowy ...................................................................................................................... 59
3.3.1. Architektura i zasada działania multipleksera .................................................................. 59
3.3.2. Komórka pamięci i wzmacniacz operacyjny ...................................................................... 60
3.3.3. Rejestr przesuwny, blok logiki kontrolnej i 4 tryby pracy. .......................................... 63
4. Analiza statystyczna aktywności dużej liczby komórek nerwowych ...................................... 66
4.1. Preparatyka wycinków mózgu myszy, hodowanie kultur i rejestracja
aktywności elektrycznej neuronów hipokampa i kory mózgowej .................................... 66
4.2. Wstępna analiza danych – wykrywanie i sortowanie potencjałów
czynnościowych ...................................................................................................................................... 68
4.3. Metody poszukiwania połączeń funkcjonalnych pomiędzy neuronami ......................... 69
4.3.1. Metody bezkierunkowe – metoda informacji wzajemnej ............................................. 69
4.3.2. Metody kierunkowe - Entropia Przejściowa ...................................................................... 69
4.3.3. Korelacja wzajemna ...................................................................................................................... 70
4.4. Związek kształtu funkcji korelacji wzajemnej z typem połączenia
funkcjonalnego ........................................................................................................................................ 71
4.4.1. Geneza kształtu funkcji korelacji wzajemnej ..................................................................... 71
4.4.2. Model formalny neuronu całkuj i strzelaj, model synapsy pobudzającej i
hamującej .......................................................................................................................................... 72
4.4.3. Kształty wykresów funkcji korelacji wzajemnej oraz odpowiadające im
konfiguracje połączeń synaptycznych. ................................................................................. 77
4.4.4. Wykrywanie połączeń synaptycznych metodą drgań losowych. Wady i
ograniczenia metody. ................................................................................................................... 81
4.5. Wydajny obliczeniowo algorytm detekcji połączeń synaptycznych ................................. 83
4.5.1. Zastąpienie drgań losowych filtracją dolnoprzepustową ............................................. 84
4.5.2 Wybór filtru cyfrowego ............................................................................................................... 85
4.5.3. Określenie istotności statystycznej korelacji wzajemnej .............................................. 89
4.5.4. Podsumowanie opracowanej metody i wnioski: .............................................................. 91
4.6. Sposoby określania rodzaju znalezionej komórki nerwowej .............................................. 93
4.6.1. Klastrowanie w przestrzeni częstotliwość - szerokość impulsu - średnia
z autokorelacji ................................................................................................................................. 94
8
4.6.2. Określenie typu komórki na podstawie korelacji wzajemnej ...................................... 95
5. Badanie połączeń funkcjonalnych w kulturach organotypowych mózgu myszy. ............... 97
5.1. Badanie połączeń pobudzających i hamujących, rozpoznawanie komórek
pobudzających i hamujących .............................................................................................................97
5.1.1. Mikrofotografie kultur organotypowych i ich rola w identyfikacji
aktywności elektrycznej poszczególnych struktur anatomicznych. ......................... 97
5.1.2. Mapy połączeń funkcjonalnych w kulturach organotypowych hipokampu
mózgu myszy ................................................................................................................................. 101
5.2. Identyfikacja połączeń zsynchronizowanych w rytmie gamma ...................................... 111
5.2.1. Geneza rytmów (fal) mózgowych. Hipotetyczny układ neuronów
generujący rytm gamma ........................................................................................................... 112
5.2.2. Wykorzystanie transformaty falkowej do automatycznego wykrywania
połączeń neuronów zsynchronizowanych........................................................................ 113
5.2.3. Półautomatyczna metoda poszukiwania par neuronów
zsynchronizowanych w rytmie gamma.............................................................................. 115
5.2.4. Wyniki półautomatycznej analizy poszukiwania par neuronów
zsynchronizowanych w zakresie rytmu fal mózgowych gamma ............................ 117
5.3. Analiza dynamiki synaptycznej połączeń pobudzających .................................................. 121
5.4. Podsumowanie wyników i wnioski .............................................................................................. 124
Podsumowanie ................................................................................................................................................... 128
Dodatek A: Sortowanie potencjałów czynnościowych ...................................................................... 130
Dodatek B: Własności transformaty falkowej i jej zastosowanie do wykrywania
kształtów na wykresach korelacji wzajemnej................................................................................. 133
Bibliografia ........................................................................................................................................................... 136
Spis Rysunków ................................................................................................................................................... 141
Spis tabel ............................................................................................................................................................... 145

9
WSTĘP
Pierwsze techniki rejestracji aktywności elektrycznej komórek nerwowych
opracowane zostały już w XIX wieku. Juliusz Bernstein przeprowadził rejestrację
potencjału czynnościowego neuronu w roku 1868 [1]. Również koncepcja stymulacji
komórki nerwowej nie jest nowa. Pierwszą udaną próbę stymulacji przeprowadził i opisał
w roku 1933 Ralph Waldo Gerard [2]. Opisu zjawiska generacji potencjału
czynnościowego w komórkach nerwowych kałamarnicy na bazie zjawisk fizycznych
dokonali Alan Hodgkin oraz Andrew Huxley [3]. Był to pierwszy fizyczny model komórki
nerwowej odwzorowujący pracę kanałów jonowych, na którym opiera się większość
modeli stosowanych współcześnie. Wszystkie te przełomowe odkrycia bazowały na
badaniach prowadzonych przy użyciu pojedynczej elektrody, których przedmiotem była
pojedyncza komórka nerwowa. Dostępne techniki eksperymentalne pozwalały na
równoczesne badanie tylko kilku neuronów – ograniczenie stanowiła możliwość
fizycznego pozycjonowania dużej liczby elektrod. W roku 1972 po raz pierwszy
w badaniach neurobiologicznych zastosowano matrycę mikroelektrod [4]; było to
otwarcie nowego rozdziału w historii badań neurobiologicznych, związane z możliwością
równoczesnej rejestracji aktywności wielu neuronów.
W eksperymentach rejestracji potencjałów zewnątrzkomórkowych in vitro
wycinek tkanki nerwowej umieszczany jest na matrycy mikroelektrod. Każda elektroda
połączona jest z układem elektroniki odczytu, wzmacniającym i filtrującym sygnały.
Elektrody zewnątrzkomórkowe znajdują się w pewnej odległości od komórek nerwowych,
przez co wartości rejestrowanych potencjałów zewnątrzkomórkowych są dużo niższe od
potencjałów transbłonowych. Może to budzić wątpliwości, czy ta metoda pozwala badać te
same własności neuronów co elektrody wkłuwane? Należy jednak pamiętać, że wkłucie
dużej liczby elektrod szklanych może prowadzić do zniszczenia niektórych komórek
i zaburzenia dział ania sieci neuronowej jako całości. Zastosowanie matryc mikroelektrod
jest metodą bardzo mało inwazyjną i zasadniczo rozwiązuje wspomniany problem.
Matryce mikroelektrod stosowane są przez wiele grup naukowych badających
działanie żywych sieci neuronowych na różnych poziomach, od pojedynczych komórek,
skupiając się na zależnościach kształtu potencjału komórkowego od gęstości kanałów
jonowych [5] aż do relacji pomiędzy grupami neuronów w mózgach ssaków [6]. Badana
tkanka i neurony rozmieszczone są na matrycy w sposób losowy, konsekwencją czego jest
rejestracja potencjałów pochodzących z wielu komórek na pojedynczej elektrodzie,
i oczywiście rejestracja napięcia pochodzącego z jednej komórki na wielu elektrodach.
Takie nieuporządkowanie w rejestrowanych danych wymusza zastosowanie algorytmów
sortujących potencjały czynnościowe. Pozwalają one na identyfikację pojedynczych
neuronów na podstawie różnic kształtów zarejestrowanych potencjałów. Potencjały
czynnościowe można sprowadzić do zapisu binarnego o określonym interwale czasowym,
gdzie 0 oznacza brak potencjału, 1 – wystąpienie potencjału czynnościowego. Zapis
binarny może zostać użyty do poszukiwania połączeń funkcjonalnych na podstawie
statystyki aktywacji neuronów w czasie w zależności od aktywacji innych neuronów.
Poszukiwanie połączeń funkcjonalnych w dużych grupach neuronów jest podstawowym
celem analizy danych przeprowadzonej w niniejszej pracy doktorskiej.
Materiałem badawczym, który był wykorzystywany do pracy nad metodami
poszukiwań połączeń funkcjonalnych między neuronami były kultury organotypowe
z wycinków mózgu myszy. Techniki hodowania kultur organotypowych znane były już
10