Table Of ContentE. Mutschler A. Schutz
H. T. Schneider (Hrsg.)
Pentaerith rityl
tetran itrat
Basisdaten zum Risikomanagement
der Koronaren Herzkrankheit
Prof Dr. med. Dr. rer. nat. Dr. h. c. E. Mutschler
Phannakologisches Institut, Biozentrum Niederursel
Marie-Curie-StraBe 9, 60439 FrankfurtlMain
Apothekerin A. Schiltz
ISIS PHARMA GmbH
GalileistraBe 6, 08056 Zwickau
Wissenschaftliche Betreuung der Reihe
Prof Dr. med. H. T. Schneider
Medizinische Fakultat Universitat Bonn
Hochschule fUr Wirtschaft und Technik (FH) Albstadt-Sigmaringen
Arbeitsgruppe Phannakologie, Anton-Giinther-StraBe 51, 72488 Sigmaringen
ISBN-13 :978-3-7985-1142-2 e-ISBN-13 :978-3-642-85444-6
DOl: 10.1007/978-3-642-85444-6
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© by Dr. Dietrich Steinkopff Verlag, Darmstadt, 1998
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Vorwort
Die organischen Nitrate gehi:iren seit mehr als 100 Jahren zu den wichtigsten Wirkstof
fen bei der Therapie der myokardialen Ischamie. Sie sind fester Bestandteil der An
fallskupierung und Anfallsprophylaxe bei der Behandlung der Koronaren Herzkrank
heit. Doch erst seit ungeHihr 10 Jahren ist bekannt, daB die Nitrovasodilatatoren Pro
drugs sind. Ihr wirksames Prinzip ist das Stickstoffmonoxid, welches 1992 zum Mo
lekiil des Jahres gewablt wurde. Die 1980 von Furchgott berichteten Befunde konnten
die Bedeutung der Endotheizellen fur die vasodilatierende Wirkung der Nitrovasodi
latatoren nachweisen. Salvador Moncada und Lou Ignarro publizierten gleichzeitig,
daB der von den Endotheizellen bei Bedarf gebildete Endothelium derived· relaxing
factor (EDRF) identisch ist mit Stickstoffmonoxid. Diese Entdeckungen setzten eine
Forschungslawine in Gang, und bei den groBen internationalen Kongressen berichten
heute Arbeitsgruppen aus aller Welt tiber die Ergebnisse ihrer NO-Forschung.
PETN gehi:irt neben Glycerol-Trinitrat, Isosorbid-Dinitrat und Isosorbid-Mononitrat
zu den am weitesten verbreiteten therapeutisch eingesetzten Nitraten. Auch tiber
PETN-Forschungsergebnisse wird auf nationalen und internationalen Kongressen
fortlaufend berichtet. Fast selbstversHindlich wurden Beitrage zu PETN auf der
Herbsttagung der Deutschen Gesellschaft fur Klinische Pharmakologie im Septem
ber 1996 in Dresden, auf der 63. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft fur
Herz-Kreislauf-Forschung, April 1997 in Mannheim, auf dem Kongress der Deut
schen Pharmazeutischen Gesellschaft und Schweizerischen Gesellschaft der Phar
mazeutischen Wissenschaft, Oktober 1997 in Ztirich und auf der Tagung der Deut
schen Gesellschaft ftir Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikolo
gie, Miirz 1998 in Mainz, vorgetragen. Neben diesen nationalen Kongressen fand
PETN Interesse auf dem 4th World Congress on Heart Failure, November 1996 in
Jerusalem, der 69th Scient. Sess. AHA November 1996 in New Orleans, auf dem
5th World Congress on Heart Failure, Mai 1997 in Washington, auf der XIX. Ta
gung der European Society of Cardiology, August 1997 in Stockholm sowie auf
dem V. Intern. Congress of NO September 1997 in Kyoto.
Einmal jiihrlich treffen sich die PETN-Arbeitsgruppen zu einem Erfahrungsaus
tausch tiber ihre Forschungsergebnisse. Sinn dieser Treffen ist die Diskussion aktu
eller Daten und intensive Beratung tiber neue Forschungsvorhaben.
IV Vorwort
Die in diesem 13. Heft der "blauen Reihe mit dem farbigen Balken" publizierten
Beitdige wurden auf dem PETN-Expertentreffen 1997 in Dresden vorgestellt und
mit den anwesenden Fachleuten diskutiert.
Mit der Entwicklung massenspektrometrischer Detektionsmethoden zur Bestim
mung organischer Nitrate in biologischem Material waren die technischen Voraus
setzungen geschaffen, die Pharmakokinetik von PETN und seinen Metaboliten mit
moleki.ilspezifischen und sensitiven Methoden zu untersuchen. Kotting und Mitar
beiter prasentierten auf dem Expertentreffen eine methodisch vereinfachte Untersu
chung der Pharmakokinetik von PETN und seinen Metaboliten Pentaerithrityltrini
trat, Pentaerithrityldinitrat und Pentaerithritylmononitrat. Mit dieser Methode ist es
moglich, das Wissen zur Pharmakokinetik von PETN weiter zu vertiefen.
Die Arbeitsgruppe urn Kojda berichtete tiber den EinfluB von PETN auf die durch
Alterung induzierte vaskulare Produktion von aktiven Sauerstoffspezies. Moglicher
weise sind am vasoprotektiven Effekt von PETN Mechanismen beteiligt, die den
vaskularen oxidativen StreB verrnindem.
Die Arbeitsgruppe von Bassenge aus Freiburg konnte spin-trap-Resultate vorstellen,
die die Annahme zulassen, daB die verstarkte in-vitro-Bildung von Sauerstoffradi
kalen und Peroxynitrit eine Schli.isselrolle bei der Langzeitanwendung von organi
schen Nitraten mit entsprechender Toleranzausbildung spielen.
Die Arbeitsgruppe von Schroder aus Halle prasentierte Daten zur cGMP-stimulie
renden Wirkung von PETN und seinen Metaboliten. Die an kultivierten LLC-PK1-
Zellen erhobenen Befunde ergaben, daB PEDiN und PE-Mono-N substantiell an
der vasodilatatorischen Wirkung von PETN beteiligt sind.
Von hohem klinischen Interesse sind die von Hohlfeld und Schror erhobenen expe
rimentellen Befunde zur Verrninderung der MyokardinfarktgroBe unter dem EinfluB
von PETN. In diesen klinisch relevanten Tierexperimenten konnte ftir PETN eine
Verbesserung der Myokardfunktion mit Reduktion der morphologischen Infarktgro
Be nach temporarem VerschluB einer Koronararterie nachgewiesen werden.
Neue Projekte zu PETN wurden von Mtiller aus Leipzig, Sehnert aus Heme, Hoh
aus Dessau und Dtick, Bemasowski aus Erfurt bzw. Schmalkalden vorgestellt. Ins
besondere die vorlaufigen Befunde der letztgenannten Arbeitsgruppe stimulierten
ein klinisch sehr interessantes Projekt zur Anderung der Dosierung von PETN.
Diese Arbeit zeigt, daB PETN, unabhangig von der Frage, ob eine Einmaldosierung
klinisch tatsachlich moglich ist, in jedem Fall als Langzeitnitrat zu bewerten ist.
Es ware wtinschenswert, wenn die begonnenen klinischen Arbeiten in naher Zu
kunft zum AbschluB gebracht werden konnten. Die aus tierexperimentellen und
sonstigen praklinischen Befunden abgeleitete besondere Stellung des PETN konnte
durch die entsprechenden klinischen Befunde erheblich untermauert werden.
E. Mutschler
A. Schutz
H. T. Schneider
Inhaltsverzeichnis
1m Gegensatz zu Nitroglyzerin fOhrt Pentaerithrityltetranitrat
zu deutlich geringerer Bildung von schadlichen Sauerstoffradikalen
in GefaBwandzelien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
B. Fink, S. Dikalov, M. Schwemmer, D. Stalleicken, E. Bassenge
PETN reduziert die Infarktgr6Be
am reperfundierten ischamischen Schweineherzen 15
T. Hohlfeld, K. Schror
PETN vermindert die durch Alterung
induzierte vaskulare Superoxidradikal-Produktion . . . . . . . . . . . . . . . . .. 25
G. Kojda, A. Hacker, E. Noack
Quantitative Bestimmung der Pentaerithrityltetranitrat Metaboliten
Pentaerithrityltrinitrat, Pentaerithrityldinitrat
und Pentaerithritylmononitrat in Humanplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 32
J. Kotting, R. Ziegler, H. Maier-Lenz
Effekte von Adenosin und der Mono- und Dinitrat-Derivate
von PETN auf die Funktion des isolierten arbeitenden Rattenherzens .. 38
G. H. Mtiller, S. Geier, H.-G. Zimmer
Dosistitrierte PETN-Therapie bei stabiler Angina pectoris ........... 45
K.-H. Dtick, A. Bemasowski, M. Stoeter
Beeinflussung der endothelialen Funktion bei Patienten
mit koronarer Herzerkrankung durch Pentaerithrityltetranitrat . . . . . . . .. 52
G. Hoh
Untersuchungen zur cGMP-stimulierenden Wirkung
von Pentaerithrityltetranitrat und seinen Metaboliten
in kultivierten LLC-PK1-Zellen ................................. 59
B. Hinz. H. SchrOder
Verzeichnis der Vorsitzenden und Referenten
Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Dr. B. Hinz
Dr. h. c. E. Mutschler lost. fur Exp. u. Klin. Phannakol.
Phannakologisches Institut u. Toxikol.
Biozentrum Niederursel Friedrich-Alexander-U niversitat
Marie-Curie-StraBe 9 UniversitatsstraBe 22
60439 FrankfurtlMain 91054 Erlangen
Prof. Dr. med. E. Bassenge Prof. Dr. H. SchrOder
Dr. M. Skatchov Institut fur Phannakologie
Dr. S. Dikalov und Toxikologie.
Dr. B. Fink Fachbereich Phannazie
Institut fur Angew. Physiologie Martin-Luther-Universitat
Hermann-Herder-StraBe 7 Halle-Wittenberg
79104 Freiburg Wolfgang-Langenbeck-StraBe 4
06099 Halle
PD Dr. med. habil. K-D. Duck
Mainzerhofplatz 13 Prof. Dr. med. T. Hohlfeld
99084 Erfurt Prof. Dr. med. K Schr6r
Institut fur Phannakologie
Dr. med. A. Bemasowski Heinrich-Heine-Universitat
Kreiskrankenhaus MoorenstraBe 5
R6tweg 6 40225 Dusseldorf
98574 Schmalkalden
Dr. med. G. Hoh
M. Gerhardt C. Muller
Dr. med. W. Sehnert Klinik fur Innere Medizin
Ev. Krankenhaus Heme Stadtisches Klinikum Dessau
WiescherstraBe Auenweg 38
44623 Heme 06846 Dessau
VIII Verzeichnis der Vorsitzenden und Referenten
Dr. 1. Kotting Dr. med. G. H. Miiller
LabConsult Gesellschaft S. Geier
fUr Laboratoriumsdiagnostik Prof. Dr. med. H.-G. Zimmer
in der Klinischen Pharrnakologie mbH Carl-Ludwig-Institut fUr Physiologie
SchauinslandstraBe 85 Universitat Leipzig
79120 Freiburg LiebigstraBe 27
04103 Leipzig
Prof. R. Ziegler
Prof. Dr. med. H. Maier-Lenz Dr. med. D. Stalleicken
Hochschule fUr Technik und Wirtschaft ISIS PHARMA GmbH
Albstadt -Sigmaringen GalileistraBe 6
FB Pharrnatechnik 08056 Zwickau
Anton-Giinther-StraBe 51
72488 Sigmaringen
PD Dr. G. Kojda
A. Hacker
Prof. Dr. med. E. Noack
Institut fUr Pharrnakologie
Heinrich-Heine-UniversiHit
MoorenstraBe 5
40225 Diisseldorf
1m Gegensatz zu Nitroglyzerin ffihrt
Pentaerithrityltetranitrat * zu deutlich geringerer
Bildung von schad lichen Sauerstoffradikalen
in GefaBwandzelien
B. Fink, s. Dikalov, M. Schwemmer, D. Stalleicken, E. Bassenge
Einleitung
Organische Nitrate wie Nitroglyzerin oder PETN werden bei der Therapie verschiede
ner kardiovaskuHirer Erkrankungen angewandt, bei denen verstarkte Vasodilatationen
in bestimmten Kreislaufabschnitten gtinstig sind, z. B. bei der Myokardischamie. Lei
der ist eine erfolgreiche Therapie mit Nitroglyzerin oder anderen organischen Nitraten
durch das Auftreten von Nitrattoleranz eingeschriinkt, die insbesondere bei der nicht
interrnittierenden Langzeitgabe eine ungtinstige Rolle spielt. Bei der Nitrat-Toleranz
handelt es sich urn ein multifaktorielles Geschehen, bei dem eine mehr oder weniger
stark ausgepragte neurohumorale Gegenregulation auftritt, femer eine verstlirkte Ak
tion verschiedener vasokonstriktorischer Hormone beobachtet wird und schlieBlich
auch deutlich abgeschwachte Dilatationen bei Freisetzung von EDRF bzw. Stickstoff
monoxid [1, 2] hervorgerufen werden. Trotz einer Reihe von Untersuchungen sind die
genauen Mechanismen, die zur Nitrat-Toleranz fiihren, noch nicht abgekllirt.
In diesem Zusarnmenhang konnte ktirzlich wlihrend Nitroglyzerin-Behandlung eine
verstarkte Bildung von Sauerstoffradikalen (ROS) [3-5] gezeigt werden. Die Inter
aktionen zwischen einer verstarkten Bildung von Superoxidradikalen auf der einen
Seite und einer gestOrten GeraBdilatation auf der anderen Seite wurden bei in-vitro
Organbad-Experimenten mit GefaBen von Nitroglyzerin-toleranten Tieren beobach
tet. Wahrend der ersten zwei Tage einer kontinuierlichen Therapie mit organischen
Nitraten kam es zu einer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems und zu einer
verstlirkten Aktivitat der NAD(P)H-Oxidase. Dabei wurde die basale Freisetzung
von O~-Radikalen signifIkant vermehrt [6, 7], wodurch das yom Endothel freige
setzte NO [8] teilweise inaktiviert und Peroxynitrit verstlirkt gebildet wurde [9].
Die Superoxidradikale reagieren sehr schnell mit NO und bilden dann umgehend
Peroxynitrit [9], welches ein starkes Oxidationsmittel darstellt [10]. Peroxynitrit rea
giert dann seinerseits ungtinstigerweise mit reduzierten Thiolen im Zytoplasma
[11]. Peroxynitrit kann deshalb verschiedene Enzymaktivitliten durch eine (ir)-rever
sible Oxidation der SH-Gruppen (z. B. auch der von 16slicher Guanylylzyklase, de
ren (NO-stimulierter) Anstieg der Aktivitlit von dem reduzierten Zustand der SH-
* Handelsname: Pentalong®
2 B. Fink et al.
Gruppen abhfulgt) reduzieren [12]; es bewirkt deshalb StOrungen der Vasomotorik
u. a. bei isolierten Herzen [13]. Die Wirkung von Nitroglyzerin als einem exogenen
NO-Donor und einem Stimulator der cGMP abhangigen Vasodilation resultiert im
mer aus der Balance zwischen der Konzentration von freigesetztem NO und der
gleichzeitigen, erhOhten Bildungsrate von Nitroglyzerin-induzierten reaktiven Sau
erstoff-Spezies (ROS) in der GefaBmuskulatur.
Urn die Mechanismen genauer zu analysieren, die zur Bildung der Nitrat-Toleranz
ruhren und urn Nitrovasodilatatoren herauszukritallisieren, die mit einer deutlich ge
ringeren gleichzeitigen ROS-Produktion verbunden sind, muB man verschiedene or
ganische Nitrate in Bezug auf die Geschwindigkeit, mit der die Nitrat-Toleranz ein
tritt, miteinander vergleichen und mit der dabei gleichzeitig auftretenden, verstark
ten Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (Superoxidradikalen und Peroxynitrit)
korrelieren. Kfirzlich wurde gezeigt, daB die nicht intermittierende Nitroglyzeringa
be sowohl unter in-vitro- als auch unter in-vivo-Bedingungen zur Toleranz ruhrt
[14, 15]. Die nicht intermittierende Gabe von PETN dagegen verursachte unter in
vivo-Bedingungen dagegen keine Toleranz [16, 17]. Wie oben schon erwahnt, ver
ursacht Nitroglyzerin unter in-vitro-Bedingungen eine verstarkte Bildung von ROS
in den GefaBwandzellen. Es gibt allerdings bisher keine quantitativen Analysen
fiber die Bildung von Superoxidradikalen und von Peroxynitrit wahrend der Meta
bolisierung von PETN im Vergleich zu Nitroglyzerin. Deshalb haben wir die Bil
dung von ROS bei Gabe von PETN bzw. Nitroglyzerin in verschiedenen vaskula
ren Zellen und im Blut genauer analysiert und quantifiziert.
Schon Wher wurde mit Hilfe des Spin-traps DMPO die Bildung von Superoxidra
dikalen in Endothelzellen genauer untersucht [18], wobei es allerdings nicht mog
lich war, die Bildungsrate der Radikale zu bestimmen. DMPO reagiert narnlich
gleichzeitig sowohl mit Superoxidradikalen als auch mit Peroxynitrit. Mit DMPO
kann somit die gleichzeitige Bildungsrate von ROS (Superoxidradikalen plus Per
oxynitrit) bestimmt werden. Wenn rur die Elektron-spin-resonance-(ESR)Analyse
jedoch TMIO als Spin-trap benutzt wird, kann man darnit ganz spezifisch die Per
oxynitrit-Bildung analysieren, ohne die gleichzeitige Superoxid-Bildung mitzuerfas
sen [19, 20]. Kfirzlich wurde beschrieben, daB mit durch Phosphorylierung sterisch
blockierten Hydroxylarninen, namlich TEMPONE-H und CP-H [21, 22], die Bil
dungsrate von Superoxidradikalen und von Peroxynitrit mit Hilfe der ESR-Detek
tierung des stabilen Nitroxylradikals TEMPONE bzw. CP [22] erfaBt werden kann.
Ziel unserer Untersuchung war also ein Vergleich zwischen der Induktion von
Nitrat-Toleranz in vitro und der verstarkten Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies
(Superoxidradikalen und Peroxynitrit), die durch Exposition von kultivierten glatten
Muskelzellen bzw. Endothelzellen sowie von Vollblut bzw. gewaschenen ex-vivo
Plattchen mit PETN- oder Nitroglyzerin-Gabe hervorgerufen wird.
Methodik
Zellpraparationen
Endothel- bzw. glatte Muskelzellen wurden von Schweineaorten gewonnen [23, 24]
und kultiviert (Gibco BRL, Kat. Nr. 31095-029, Life Technologies, Eggenstein,
1m Gegensatz zu Nitroglyzerin fUhrt Pentaerithrityltetranitrat ... 3
Deutschland), wie von Feelisch beschrieben [25]. Die Reinheit der Endothelzellen
und glatten Muskelzellen wurde nach einem Vorschlag von Hecker und Battle ana
lysiert [23, 24]. Die Funktionstuchtigkeit der Zellen wurde mit dem Fluoreszenz
Mikroskop untersucht sowie mit durch Natrium-Nitroprussid stimulierten Anstiegen
des cGMP Gehaltes nachgewiesen, wie von Salvemini [26] beschrieben.
Gewaschene ex-vivo-Blutpll:ittchen wurden von Hunden gewonnen, die niclJ.t mit
Nitraten behandelt worden waren. Die Plattchen wurden gewaschen und in Phos
phatpuffer (PBS) resuspendiert [27]. Die Endothelzellen (4000 Zellen/Ill) und glat
ten Muskelzellen (2500 Zellen/Ill) wurden von Zellkulturen gewonnen (5. Passage);
gewaschene Plattchen (l 00000/111) wurden mit 0,5 mM Nitroglyzerin in Phosphat
pufferlosung fUr 15 min bei 20DC in Gegenwart von Cystein (20 11M) inkubiert
[28]. Urn die Toleranz gegenuber Nitroglyzerin oder PETN zu induzieren, wurden
die Endothelzellen in Kultur entweder mit Nitroglyzerin oder mit Nitroglyzerin
plus Vitamin C (20 Ilg/rnl) als Antioxidans oder mit PETN jeweils fUr 24 Stunden
bei 37 DC inkubiert (bei einer anfanglichen Konzentration der Nitrate von 10 11M)
[26]. Die Aktivitat der Plattchen wurde als Thrombin-induzierter Anstieg der intra
zelluliiren Calcium-Konzentration mit Hilfe der Fluoreszenztechnik mit FURA 2 ge
messen, wie von Bassenge und Fink [27] beschrieben. Die Proteinkonzentration
wurde nach Lowry vorgenommen [29]. Das Blut wurde von der A. carotis der
Hunde direkt in eine Zitrat-Losung (6: 1 vol/vol) [27] uberfuhrt.
Electron-Spin-Resonance (ESR)
Die Zellen wurden in Phosphatpufferlosung (pH 7,4) in Gegenwart von 0,2 mM
DTPA und 0,9% NaCl resuspendiert. Die ESR-Analysen wurden in Quarzkapilla
ren mit einem Innendurchmesser von 1 mm vorgenommen. Urn die Bildung von
Hydroxylradikalen aus H 0z, die durch kleinste Spuren von Ubergangsmetallen
2
(z. B. Fe2+) katalysiert wird, zu unterdrucken, wurde DTPA zu den Zell-Suspensio
nen hinzugefUgt [18]. Eine Anwesenheit von unerwunschten paramagnetischen Ver
unreinigungen in den Originallosungen wurde durch entsprechende ESR-spektro
skopische Untersuchungen ausgeschlossen. Die ESR-Analysen wurden bei Raum
temperatur durchgefUhrt, wobei ein EMX-A-ESR-Spektrometer der Firma Bruker,
Karlsruhe benutzt wurde. Die ESR-Daten waren wie folgt: Feldzentrum 3474 G;
Field-sweep (Durchgang) 60 G; Mikrowellenfrequenz 9,72 GHz; Mikrowelleninten
sitat 20 mW; Magnetic-field-modulation 100 kHz; Modulationsamplitude 2,0 G;
Konversionszeit 655 ms; Detektor-Zeitkonstante 1024 ms; Magnetic-field-sweep
time (Durchgangszeit) 671 s. Die ESR-Spektren wurden 5 Minuten nach Equilibrie
rung der entsprechenden Zell-Suspensionen in der ESR-Lochbohrung aufgenom
men.
Superoxidradikal-Bestimmung
Die Superoxidradikal-Bildung in Plattchen, glatten Muskel- und Endothelzellen
wurde mit Hilfe des Spin-traps DMPO mit einer Konzentration von 0,1 M quantifi
ziert, wobei das Dimethylsulfoxid-(DMSO-)resistente DMPO-OH-Spin-adduct dazu
benutzt wurde [22]. Die DMSO-Konzentration in den Zell-Suspensionen (0,1%)
diente als Scavenger fUr gleichzeitig entstehendes Peroxynitrit. Die DMPO-OH-Bil
dung in den entsprechenden Zell-Suspensionen wurde mit Hilfe der Amplitude der
