obtención de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos a partir de residuos lignocelulósicos del

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OBTENCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS Y
POLISACÁRIDOS A PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS DEL
DEPARTAMENTO DE CALDAS EMPLEANDO MACROMICETOS DE
PUDRICIÓN BLANCA POR FERMENTACIÓN SUMERGIDA Y
FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO

SANDRA MONTOYA BARRETO

Facultad de Ciencias Agropecuarias
Doctorado en ciencias Agrarias
Universidad de Caldas
Manizales, Colombia, 2012

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OBTENCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS Y POLISACÁRIDOS A
PARTIR DE RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS DEL DEPARTAMENTO DE CALDAS
EMPLEANDO MACROMICETOS DE PUDRICIÓN BLANCA POR FERMENTACIÓN
SUMERGIDA Y FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO

Tesis para optar el título de
Doctora en Ciencias Agrarias de:

SANDRA MONTOYA BARRETO

Bajo la dirección del Doctor:

ÓSCAR JULIÁN SÁNCHEZ TORO

Facultad de Ciencias Agropecuarias
Doctroado en Ciencias Agrarias

Manizales, 2012
Agradecimientos

Institutciones y oficinas

Universidad de Caldas:
 Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados, por la financiación de la Tesis Doctoral
 Departamento de Ingeniería, por el aval para la comisión de estudios.
 Instituto de Biotecnología Agropecuaria, por el uso de los laboratorios y sus instalaciones
para el desarrollo de la Tesis.
 Grupo de alimentos y Agroindustria, por el apoyo permanente durante el desarrollo de la
investigación.

Universidad de Buenos Aires, por el apoyo con la pasantía realizada en el Departamento de
Biodiversidad y biología Experimental.

Universidade Federal Do Paraná, por el apoyo con la pasantía realizada en el Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular.

Doctores e investigadores

 Doctor Óscar Julián Sánchez Toro, Director de la tesis Doctoral, por su apoyo y
orientación permanentes en cada uno de los procesos académicos durante el desarrollo de
todo el trabajo.
 Doctora Laura Levín, Codirectora de la Tesis Doctoral, por su apoyo permanente y
orientaciones pertinentes durante todo el proceso de formación doctoral.
 Doctoras Lucía Atehortúa, profesora de la Universidad de Antioquia y Aida Rodriguez de
Stouvenel, porfesora de la Universidad del Valle, quienes conforman el Comité tutorial de
mi Tesis Doctoral, por su evaluación oportuna y participación en los eventos académicos
relacionados con la Tesis Doctoral.
 Prof. Arkady P. Sinitsyn, Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences,
Department of Chemical Enzymology, Moscow State University, Russia, por su apoyo y
orientación durante visita académica a la Universidad de Caldas en el año 2011.

Estudiantes de Postgrados, Ingenieros y Compañeros

 Profesor Óscar Darío Hernández, por su apoyo y colaboración en la construcción y
desarrollo de los modelos matemáticos desarrollados en este trabajo.
 Profesional Diego Fernado Arias Monsalve, por su colaboración con el trabajo de campo
realizado para la Tesis.
 Profesionales Patricia Salazar Villegas y Silvio Alexandro Gómez saldarriaga, por la
colaboración y apoyo con el trámite de la solcitud de Patente de Biorreactor de lecho fijo.
Agradecimientos personales
Especialmente a mi hijo por su compañía permanente, su amor y apoyo complice; a mi esposo
por su paciencia y solaridad.
TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción 4
1.1. Contexto general 4
1.2. Objetivos de la tesis 8
2. Estado del Arte y Marco Teórico 10
2.1. Los hongos 10
2.1.1 Generalidades de los hongos 10
2.1.2. Biología d elos hongos 12
2.1.3 Crecimeinto y desarrollo de los hongos 13
2.1.4. Investigaciones con hongos en Colombia 15
2.2. materiales lignocelulósicos 20
2.2.1. Celulosa 22
2.2.2. Hemicelulosa 24
2.2.3. Lignina 25
2.2.4. Otros polímeros presentes en los materiales lignocelulósicos 27
2.2.5. Pretratamiento de los materiales lignocelulóscios 28
2.3. Enzimas lignocelulolíticas 30
2.3.1. Enzimas celulolíticas 31
2.3.2. Enzimas xilanolíticas 37
2.3.3. Enzimas ligninolíticas 38
2.3.4. Otras enzimas producidas por hongos de pudrición blanca 43
2.3.5. Aplicaciones de las enzimas 44
2.4. Polisacáridos fúngicos 45
2.5. fermentación sumergida 48
2.6. Fermentación en estado sólido 50
2.7. Modelamiento de las cinéticas de fermentación de hongos de pudrición blanca 54
2.8. Evaluación de biomasa fúngica, enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos 57
2.8.1. Detarminación de biomasa celular 57
2.8.2. Rastreo de cepas para la producción de biosustancias 58
2.8.3. determinación de actividades enzimáticas lignocelulolíticas 59
2.8.4. Determinación de polisacáridos 59
Referencias 60
3. Evaluación de Actividades Endoglucanasa, Exoglucanasa, Lacasa y Lignina Peroxidasa en
Diez hongos de pudrición blanca 72
4. Producción de Polisacáridos por Cultivos Sumergidos y en Estado sólido a partir de diferentes
basidiomicetos 86
5. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la degradación de Sustratos
Lignocelulósicos mediante Fermentación en Estado Sólido con Pleurotus ostreatus, Coriolus
versicolor y Lentinus edodes 98
6. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la degradación de Sustratos
Lignocelulósicosproducción de polisacáridos mediante Fermentación en Estado Sólido con
Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y Lentinus edodes 120
7. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la degradación de Sustratos
Lignocelulósicos mediante Fermentación Sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor
y Lentinus edodes 139
8. Selección de la mejor Combinación Hongo – Formulación para la producción de exo-
polisacáridos mediante Fermentación Sumergida con Pleurotus ostreatus, Coriolus versicolor y
Lentinus edodes 163
9. Biorreactor para la Obtención de Ssutancias Bioactivas por Fermentación en Estado Sólido
Empleando Hongos Macromcietos (Solicitud de Patente) 181
10. Conclusiones Generales 184
10.1. Contribuciones de la Tesis 184
10.2. Impactos Potenciales de la Tesis 186
10.3. Trabajos Futuros 187
Anexos 1. Documento Solictud de Patente
Anexo 2. Obtención de polisacáridos del cuerpo fructífero Grifola frondosa
Anexo 3. Aprobación de proyecto Colciencias
1. Introducción

1.1. Contexto general

1.1.1. Campo de aplicación y motivación

La producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos a partir de hongos de pudrición blanca
empleando residuos lignocelulósicos como sustratos ha sido estudiada en diversos centros de
investigación y universidades en el mundo con múltiples resultados a escala de laboratorio. Sin embargo,
no hay disponible información suficiente sobre los procesos industriales para la obtención de estos
productos, ni sobre su escalamiento. Tampoco existe información suficiente y disponible en torno a la
producción de polisacáridos fúngicos empleando residuos lignocelulósicos como sustratos, diferenciando
la fuente de los polisacáridos fúngicos como son el cuerpo fructífero de los hongos, el micelio vegetativo
o los medios de cultivo procedentes de las fermentaciones sumergidas. De igual forma, se ha detectado
que muchos de los problemas que se presentan en el escalamiento y montaje de los procesos industriales
para la producción de biosustancias empleando hongos macromicetos sobre matrices sólidas heterogéneas,
como son las diversas mezclas de materiales lignocelulósicos, se deben a la ausencia de modelos
matemáticos adercuados que describan y permitan la articulación entre el crecimiento y desarrollo de los
macromicetos de pudrición blanca, el consumo de los sustratos y la producción de las sustancias con valor
comercial.
Varios fueron los motivos que nos llevaron a encarar este trabajo en el marco del Doctroado en
Ciencias Agrarias de la Universidad de Caldas, entre los que se destacaron:

 En Colombia son escasos los trabajos de investigación en torno a la producción de enzimas
lignocelulolíticas obtenidas a partir de hongos de pudrición blanca empleando residuos
lignocelulósicos como sustratos en procesos de fermentación sumergida y en estado sólido.
 En la producción de polisacáridos de hongos de pudrición blanca se requiere información en torno a
la descripción de las clases de polisacáridos que pueden obtenerse dependiendo si éstos se encuentran
en el cuerpo fructífero, en el micelio o son excretados al medio de cultivo. Asimismo, es reducida la
información en torno a los esquemas de extracción de polisacáridos y a su identificación y
cuantificación.
 No sehan establecido pleanemente los medios de cultivo basados en materiales lignocelulósicos
pretratados utilizados en fermentación sumergida para la producción de polisacáridos a partir de
hongos de pudrición blanca.
 Existen escasas propuestas en referencia a modelos matemáticos que permitan la descripción del
crecimiento y desarrollo de los hongos de pudrición blanca y la producción de biosustancias como
metabolitos primarios y secundarios a fin de buscar el escalamiento de los procesos (nivel piloto)
para su producción industrial.

La producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos de hongos de pudrición blanca
empleando mezclas de residuos lignocelulósicos es bastante compleja por todas las interacciones que se
presentan entre la biomasa, el sustrato y las nuevas sustancias producto del metabolismo del hongo; estas
sustancias son a su vez necesarias para realizar la conversión de la matriz polimérica del sustrato,
constituida principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina, en sustancias pequeñas que le sirvan de
fuente de energía para su crecimiento y desarrollo. Esta tesis doctoral intenta describir los procesos de
obtención de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos, como productos del metabolismo de estos hongos.
Este trabajo fue realizado entre agosto de 2009 y diciembre de 2012, con el soporte económico de la
Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados, el Instituto de Biotecnología Agropecuaria y el
Departamento de Ingeniería de la Universidad de Caldas; adicionalmente, se contó con el apoyo parcial de
la Gobernación de Caldas con cargo a los recursos de la estampilla para proyectos de investigación de las
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universidades públicas del Departamento de Caldas. La autora de esta tesis realizó una pasantía
internacional en dos instituciones de reconocida trayectoria en el campo de aplicación que aborda el
presente trabajo: Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidade Federal do Paraná
(Curitiba, Brasil) y el Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental de la Universidad de
Buenos Aires (Argentina).
Durante el desarrollo de esta investigación se realizaron dos trabajos paralelos que complementan
esta tesis y hacen parte de los productos obtenidos como aplicaciones de los conocimientos adquiridos, los
cuales son: i) Diseño y puesta en marcha de la Planta de Bioprocesos de la Universidad de Caldas, la
cual consta de seis unidades de proceso, compostaje, cultivo de hongos macromicetos, planta de
tratamiento de aguas residuales, lombricultivo, unidad de fermentaciones sumergidas con biorreactores
bajo condiciones controladas y unidad de fermentaciones en estado sólido con biorreactores bajo
condiciones controladas; la cual se encuentra operando desde diciembre de 2011; y ii) planteamiento y
desarrollo del proyecto Desarrollo y evaluación de los parámetros de cultivo a escala semi industrial del
hongo Grifola frondosa en climas tropicales y su transformación con fines comerciales como productos
nutraceúticos. Este proyecto se encuentra en la ejecución de su primera etapa que corresponde al estudio
de mercado del producto y a pruebas piloto de producción.
El espectro de aplicación de este trabajo se resume en la importancia de ampliar el conocimiento en
torno a la producción de enzimas lignocelulolíticas de los hongos de pudrición blanca Coriolus versicolor,
Lentinus edodes y Pleurotus ostreatus (seleccionados de entre 10 especies de hongos) sobre 12
formulaciones diferentes en fermentaciones sumergida y en estado sólido bajo condiciones controladas.
Esta importancia radica no solamente en la relevancia comercial que puede llegar a tener la producción de
enzimas de este tipo, sino porque el conocimiento acerca de cómo estos hongos producen estas enzimas,
permiten profundizar en el conocimiento del funcionamiento de los hongos de pudrición blanca, lo cual
posibilita incrementar la eficiencia en los cultivos de hongos para la obtención de sus cuerpos fructíferos,
y de otras sustancias como polisacáridos de micelio y exopolisacáridos de los medios de cultivo en
procesos de fermentación sumergida. De igual forma, se amplía el conocimiento en referencia al potencial
que presentan los polisacáridos de los hongos macromicetos y su importancia como potenciadores del
sistema inmunológico, para lo cual es relevante dilucidar los esquemas de extracción y la importancia de
la obtención de las diferentes fracciones y su acción sinérgica.

1.1.2. Estructura de la tesis

El documento de la tesis se desarrolló en 10 capítulos. En el capítulo dos se presenta el estado del arte
de la tesis, el cual contiene una descripción acerca de los hongos, los materiales lignocelulósicos, las
enzimas lignocelulolíticas, los procesos de fermentación sumergida y en estado sólido, la producción de
polisacáridos fúngicos, los modelos matemáticos, los métodos analíticos para determinar las actividades
enzimáticas y polisacáridos, y la realización de rastreos para la producción de enzimas y polisacáridos de
cepas fúngicas. En la revisión realizada sobre los hongos se contemplaron sus generalidades, su biología,
crecimiento y desarrollo y un compendio de trabajos realizados en Colombia empleando hongos. En la
sección de materiales lignocelulósicos, se encontrará información relacionada con la composición química
de estos materiales y su distribución dentro de la matriz lignocelulósica, que permita dilucidar cómo
pueden ser atacadas estas estructuras por las enzimas lignocelulolíticas producidas por los hongos de
pudrición blanca. De igual forma, en esta sección se encontrará un compendio sobre tipos de
pretratamientos que se les puede realizar a los materiales lignocelulósicos a fin de desordenar la matriz
lignocelulósica y permitir más fácilmente el acceso de los hongos de pudrición blanca a estos materiales
en procesos de fermentación sumergida. En la sección 2.3 se encontrará información general sobre las
enzimas lignocelulolíticas, los tipos de estas enzimas producidas por los macromicetos de pudrición
blanca, su modo de acción sobre los materiales lignocelulósicos y las aplicaciones de ellas en diferentes
sectores industriales. En la sección 2.4 se encontrará un compendio sobre polisacáridos fúngicos, las
clases de polisacáridos contenidos en la pared celular fúngica, cómo se producen, las funciones
fisiológicas y su utilidad en la industria farmacéutica. En las secciones 2.5 y 2.6 se tratan los procesos de
fermentaciones sumergidas y en estado sólido respectivamente con hongos de pudrición blanca, en las
cuales se describe la importancia de conocer el comportamiento de estos hongos en cada uno de los
procesos con sus ventajas y desventajas para producción a escala industrial. En la sección 2.7 se hace un
compendio sobre el modelamiento de las cinéticas de fermentación de hongos de pudrición blanca, en el
que se exponen las expresiones matemáticas más utilizadas para el ajuste de datos experimentales de
procesos de fermentación sumergida y en estado sólido, así como los problemas que representa la ausencia
de modelos para el escalamiento de estos procesos productivos a tamaño industrial. La última sección de
este capítulo trata sobre cómo se realiza la evaluación de biomasa fúngica, enzimas lignocelulolíticas y
polisacáridos; en ella se discute cómo se determina la biomasa en procesos de fermentación en fase sólida
por estimación indirecta, utilizando la medida de N-acetil-D-glucosamina (NAGA), el cual es precursor de
quitina, componente mayoritario de la pared celular de los hongos. En esta sección también se hace
referencia a los métodos para realizar el rastreo de cepas para la producción de biosustancias, en particular
de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos. En la última parte de esta sección se describen los métodos
para determinar actividades enzimáticas lignocelulolíticas y polisacáridos.
En el capítulo tres se encontrará el primer artículo producto de esta tesis doctoral: “Polysaccharide
production by submerged and solid state cultures from several basidiomicetes”, aceptado para su
publicación en la revista International Journal of Medicinal Mushrooms. Este artículo es el resultado del
rastreo de polisacáridos realizado a diez especies de hongos de pudrición blanca con el fin de seleccionar
la mejor cepa para la producción de exopolisacáridos y el cuerpo fructífero de mayor contenido de
intrapolisacáridos. A su vez, el capítulo cuatro contiene el artículo: “Evaluación de las actividades
endoglucanasa, exoglucanasa, lacasa y lignina peroxidasa en diez hongos de pudrición blanca”, como
resultado del rastreo de enzimas lignocelulolíticas realizado a las diez cepas de hongos de pudrición
blanca con el fin de seleccionar las mejores cepas productoras de celulasas y ligninasas.
En los capítulos cinco, seis, siete y ocho se encontrarán los artículos realizados como compendio de
los resultados obtenidos en el diseño experimental como elemento central de esta tesis. Los capítulos
cinco y seis corresponden a la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos por fermentación
en estado sólido, respectivamente, y los capítulos siete y ocho están relacionados con la producción de
enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos por fermentación sumergida.
En el capítulo nueve se encontrará el documento petitorio de la patente: “Biorreactor para la
obtención de sustancias bioactivas por fermentación en estado sólido empleando hongos macromicetos”,
en el cual se describe el diseño, construcción y puesta en marcha de un biorreactor de lecho fijo para
fermentación en fase sólida con hongos de pudrición blanca para la producción de biosustancias como
enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos. Por último en el capítulo diez se encontrará la discusión general
de la tesis, en la que se condensarán los resultados generales obtenidos, los impactos y las perspectivas
futuras del trabajo.

1.2. Objetivos de la Tesis

1.2.1. Objetivo general

Obtener enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos a partir de residuos lignocelulósicos disponibles en
el Departamento de Caldas empleando macromicetos de pudrición blanca tanto por fermentación
sumergida como por fermentación en estado sólido.

1.2.2. Objetivos específicos

 Determinar la influencia de los medios de cultivo formulados con base en los residuos
lignocelulolíticos seleccionados disponibles en el Departamento de Caldas sobre la producción de
enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos empleando macromicetos de pudrición blanca por
fermentación en medio líquido.
 Determinar la influencia de los medios de cultivo formulados con base en los residuos
lignocelulolíticos seleccionados disponibles en el Departamento de Caldas sobre la producción de
enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos empleando macromicetos de pudrición blanca por
fermentación en estado sólido.
 Realizar y caracterizar cinéticamente los procesos de fermentación sumergida y en estado sólido a
nivel piloto para la producción de enzimas lignocelulolíticas y polisacáridos empleando macromicetos
de pudrición blanca.
2. Estado del Arte y Marco Teórico

2.1. Los hongos

2.1.1. Generalidades de los hongos

Los hongos tienen una importancia fundamental como organismos descomponedores en el ambiente
terrestre, ellos juegan un rol importante en los ciclos bio-geoquímicos de carbono, nitrógeno, fósforo y otros
(Wainwright, 1988; Gadd, 1999). Los hongos hacen parte de una comunidad natural con plantas, otros
microorganismos e invertebrados, esta combinación demuestra la condición mutualista de los hongos en el
planeta y los pone como integrantes importantes en los procesos que involucran los ciclos ambientales de la
tierra (Bosell et al., 2003). Adicionalmente, la importancia de los hongos se incrementa por su uso en la
producción industrial de alcoholes, antibióticos, ácidos orgánicos, prebióticos, diversas sustancias de uso
farmacológico, enzimas, además del gran potencial de uso en procesos de biorremediación, control
biológico, entre otros (Burgstaller y Schinner, 1993; Tobin et al., 1994; Gadd, 2001).
Los hongos son organismos celulares sin cloroplastos y por lo tanto heterótrofos que poseen paredes
celulares compuestas de quitina y células con especialización funcional. Actualmente se consideran como un
grupo heterogéneo, formado por organismos pertenecientes por lo menos a tres líneas evolutivas
independientes (Whittaker, 1969; Naeem, 2002). Los hongos son organismos eucarióticos uni o
pluricelulares que se desarrollan en sitios húmedos y con poca luz. Las células de los hongos pluricelulares
se agrupan en filamentos llamados hifas que en conjunto reciben el nombre de micelio (Hudson, 1986;
Chang y Miles, 2004). Los hongos descomponen la materia orgánica por medio de enzimas, absorbiendo las
sustancias nutritivas. La reproducción puede ser asexual o sexual, principalmente por esporas. La mayor
parte de los hongos son saprofitos; algunos se consideran parásitos; otros mutualistas o simbiontes basados
en asociaciones con algas, líquenes o con otro grupo en forma de micorrizas, en los que los hongos
acompañan a la mayor parte de las plantas, residiendo en sus raíces y ayudándolas a absorber nutrientes del
suelo. Se piensa que esa simbiosis fue esencial para la conquista del medio terrestre por las plantas y para la
existencia de los ecosistemas continentales (Hudson, 1986; Naeem, 2002).
Otras características de los hongos pueden resumirse diciendo que carecen de tejido vascular y que no
tienen movimiento. Mientras el componente principal de la pared celular de las plantas está formado por
celulosa, la de los hongos contiene mayoritariamente quitina (Carlile et al., 2001). Los hongos son
heterotróficos, igual que los animales, pero los animales primero ingieren y después digieren y los hongos
primero digieren y después ingieren por medio de la producción de moléculas más simples. La mayoría de
los hongos, como los animales, almacenan alimentos como glucógeno; mientras las plantas almacenan
almidones, celulosas y azúcares simples. Los saprófitos se alimentan de materia orgánica en descomposición.
La falta de clorofila afecta profundamente su forma de vida: no necesitan de la luz. Crecen en cualquier
dirección; invaden el sustrato con filamentos absorbentes. Junto con las bacterias, su función principal es
reciclar el carbono, el nitrógeno y los minerales esenciales para la nutrición. Como parásitos, usan la materia
orgánica de organismos vivos, causando daño a plantas, animales y humanos (por las toxinas que producen).
En simbiosis, pueden beneficiar a otros organismos, como las micorrizas en las raíces de las plantas y los
líquenes (asociación de un hongo y un alga). Son organismos muy útiles por su versatilidad genética y
fisiológica, producen enormes cantidades de esporas que permanecen viables hasta que las condiciones
climatológicas favorecen su multiplicación. Descomponen toda clase de productos manufacturados,
exceptuando los plásticos y algunos plaguicidas. Los hongos son muy útiles al ser humano, los hay que
producen antibióticos, hormonas y esteroides y muchas más sustancias. Son muy importantes en la
investigación, debido a que se reproducen rápida y fácilmente, ocupan poco espacio y su ciclo de vida puede
ser controlado a conveniencia de los procesos (Whittaker, 1969; Moore, 1998a; Carlile et al., 2001). Las
características moleculares (recién descubiertas) indican que los hongos están más relacionados con los
animales que con las plantas (Hudson, 1986; Naeem, 2002).
Existen diferencias entre los micromicetos y macromicetos. En las hifas de los micromicetos u hongos
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