Nouveau design de sondes pour biopuces ADN fonctionnelles et caractérisation des capacités de

420 Pages·2017·5.43 MB·French

by  Sébastien Terrat

UNIVERSITE BLAISE PASCAL UNIVERSITE D’AUVERGNE
N° D.U. 2061 ANNEE 2010
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES
DE LA VIE ET DE LA SANTE
N° d’ordre 528
THESE
Présentée à l’Université Blaise Pascal
Pour l’obtention du grade de
DOCTEUR D’UNIVERSITE
(Spécialité : GENOMIQUE ET ECOLOGIE MICROBIENNE)
Présentée et soutenue publiquement le
Le 15 Octobre 2010
Sébastien TERRAT
NOUVEAU DESIGN DE SONDES POUR BIOPUCES ADN
FONCTIONNELLES ET CARACTERISATION DES CAPACITES DE
BIODEGRADATION DES COMMUNAUTES BACTERIENNES DE SOLS
POLLUES PAR DES HYDROCARBURES
JURY
Présidente :
Arlette DARFEUILLE-MICHAUD (Pr., JE 2526, Université d’Auvergne, Clermont-Ferrand)
Rapporteurs :
Pascale BAUDA (Pr., UMR CNRS 7146, Université Paul Verlaine, Metz)
Guy PERRIERE (DR CNRS, UMR CNRS 5558, Université Claude Bernard Lyon I, Villeurbanne)
Examinateurs :
Robert DURAN (Pr., UMR IPREM 5254, Université de Pau et des Pays de l'Adour, Pau)
Pierre PEYRET (Pr., UMR CNRS 6023, Université d’Auvergne, Clermont-Ferrand)
Directeur :
Eric PEYRETAILLADE (Dr., UMR CNRS 6023, Université d’Auvergne, Clermont-Ferrand)
Laboratoire Microorganismes : Génome et Environnement – UMR CNRS 6023
Equipe Génomique Intégrée des Interaction Microbiennes
Université Blaise Pascal, Clermont-Ferrand

REMERCIEMENTS
Je souhaite exprimer mes remerciements à Christian Amblard, directeur du laboratoire
Microorganismes, Génome et Environnement (UMR CNRS 6023), pour m’avoir accueilli au
sein de son laboratoire et permis de réaliser cette thèse dans de bonnes conditions.
Je tiens également à remercier le professeur Pierre Peyret, pour m’avoir accueilli dans
son équipe. Merci pour sa grande disponiblité et pour nos nombreuses réunions afin d’orienter
au mieux les travaux de cette thèse. Je lui dis merci également pour m’avoir fait profiter de
ses connaissances scientifiques qui m’ont beaucoup aidé, et m’ont donné le goût de la
recherche, et ce depuis le début de mes études à l’IUT.
J’adresse un très grand merci à mon directeur de thèse, Eric Peyretaillade, tout d’abord
pour m’avoir encadré scientifiquement et humainement tout au long de cette thèse. Je veux
également le remercier pour toute l'aide qu'il m'a apporté sur mes travaux, pour sa patience
avec un étudiant parfois borné, et surtout pour ses encouragements durant ces quatre années
au sein de l’équipe. Je le remercie également pour son soutien durant les moments difficiles
de cette thèse, et particulièrement durant mes baisses de moral. Je tenais aussi à le remercier
pour son omelette aux cèpes, formidable découverte gustative que j’ai eu le plaisir de manger
chez lui.
Mes remerciements vont aussi à Olivier Gonçalves pour sa bonne humeur, son humour
(parfois grinçant), sa gentillesse et son soutien tout au long de cette thèse, mais aussi durant
mon stage de Master Recherche dans cette équipe.
Je tiens à exprimer mes remerciements les plus sincères à Guy Perrière et Pascale
Bauda, pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de juger ce travail, ainsi qu’à Arlette
Darfeuille-Michaud et Robert Duran pour avoir accepté d’examiner ce travail et de faire partie
de ce jury de thèse.
Je remercie Julien Troquet, directeur de Biobasic Environnement, et Cédric Vachelard
pour le matériel biologique fourni et les données associées dans le cadre d’un projet commun.
Merci aussi à Delphine Boucher et à Corinne Petit pour leurs connaissances qu’elles
m’ont fait partager durant ces années. Merci à Delphine pour l’aide dans la rédaction de ce
mémoire. Merci à Corinne pour son humour fracassant pendant ces années de thèse.

Merci à tous les membres de l’équipe GIIM pour m’avoir supporté pendant ces
quelques années, et surtout pour avoir accepté mon humour parfois déroutant. Merci à eux
pour m’avoir donné un environnement de travail agréable grâce à leur présence, leur bonne
humeur et leur soutien. Merci également aux étudiants qui sont passés quelques mois dans
l’équipe pour laur aide et leur gentillesse: Nicolas Parisot, Xavier Brotel, Yann Keriou,
Mélanie Mitchell, Amandine Olivier, Mathieu Roudel, Maxime Ossedat, et j’en oublie
sûrement.
Un merci particulier à Anne Moné et à Brigitte Chebance pour leur gentillesse, leur
soutien sans faille, et leur disponibilité tout au long de ces années. Merci à toutes les deux
pour avoir été présentes pendant les moments difficiles, et pour leur oreille attentive.
Je souhaite aussi remercier Cécile, Ourdia, Emilie, Eric et Jérémie pour leurs
discussions de couloirs, leur gentilesse, leur humour et leur ouverture d’esprit. Merci à eux
d’avoir été à la fois mes collègues, mais aussi mes amis. Merci aussi à Aurélie, Marlène,
Emeline, Olivier, Séréna ainsi qu’aux autres thésard(e)s, étudiant(e)s ou personnel(le)s du
laboratoire LMGE pour leur aide et leur soutien. Un grand merci à Jérôme Brunellière (dit Mr
Confidentiel, ou encore Mr Dupont….), pour son amitié, sa bonne humeur, et son aide durant
cette thèse. Pour nos compétitions sportives ou vidéoludiques, pour nos discussions
interminables, etc… Je n’ai qu’un mot à te dire : Chaussette.
Je n’oublie pas mes amis de Clermont, qui sont là depuis de nombreuses années, et qui
m’ont toujours soutenu durant cette thèse. Donc merci à Aurélie, Benoît, Florent, Fabien,
Guillaume, Emilie, Julie, Antoine, Florence, Thomas, Anaïs, Julien, Xavier et Bruno, le noyau
dur de Clermont-Ferrand, pour nos soirées, nos pokers, nos barbecues. Merci aussi à Valérie,
Abdel, Julien, Emilie, Agnès, Rémi et Christophe, pour avoir été là.
Un immense merci à mes parents et à mes grands-parents pour m’avoir soutenu durant
mes études, et d’avoir accepté mes choix. Merci pour leur présence, leur aide, leur
compréhension et leur amour. Merci aussi à Nadège, sans qui je ne serai pas arrivé à faire
cette thèse, pour son soutien et son amour indéfectible. Je leur dédie cette thèse.
Enfin, je tiens à remercier le laboratoire Bristol Myers Squibb pour l’invention de
l’Efferalgan®, sans qui cette thèse aurait été encore plus difficile.

Nouveau design de sondes pour biopuces ADN fonctionnelles et
caractérisation des capacités de biodégradation des communautés
bactériennes de sols pollués par des hydrocarbures
Résumé :
Les activités humaines sont à l’origine de nombreuses pollutions par des hydrocarbures au
niveau des écosystèmes, et plus particulièrement au niveau des sols. Afin de préserver la santé
humaine et environnementale, il est nécessaire d’éliminer les polluants présents. Dans ce but,
les techniques de bioremédiation apparaissent aujourd’hui comme de réelles alternatives aux
techniques classiques, invasives et onéreuses. Cependant, l’utilisation optimale de tels
procédés nécessite une meilleure connaissance des capacités métaboliques des communautés
microbiennes impliquées dans la biodégradation de ces polluants. Dans ce cadre, l’utilisation
des biopuces ADN fonctionnelles pour analyser ces écosystèmes semble très appropriée.
Cependant, une de ses limitations actuelles est la détermination des sondes, qui ne ciblent que
les gènes dont les séquences ont été caractérisées. Pour cela, un outil informatique (Metabolic
Design) a été mis au point, afin de déterminer des sondes exploratoires pour biopuces
fonctionnelles. L’étude, avec notre biopuce fonctionnelle, des capacités métaboliques de
dégradation des HAP de la souche Sphingomonas paucimobilis sp. EPA505 a permis de
mettre en évidence la sensibilité et la spécificité des sondes développées, ainsi que leur aspect
exploratoire. Puis, nous nous sommes attachés à caractériser les capacités métaboliques des
communautés bactériennes d’un sol pollué principalement par des HAP, sans a priori sur les
séquences ou les organismes présents, montrant l’efficacité de notre approche.
Mots-clés : biopuce fonctionnelle, hydrocarbures aromatiques polycycliques, design de
sondes, sondes exploratoires.
New probe design for functional DNA microarrays and characterization of
biodegradation capacities of bacterial communities from hydrocarbons
contaminated soils
Abstract:
Soil ecosystems are sensitive to damage from pollutions, and there is an increasing need to
develop better methods for removing pollutants from soils. The removal of pollutants, such as
polycyclic aromatic hydrocarbons, by bioremediation, is a less invasive and expensive process
than classical decontamination. However, use and optimization of bioremediation treatments
require knowledge on metabolic capacites of microbial communities involved in the
biodegradation of such pollutants. To assess their huge metabolic potentialities, we need high
throughput tools, such as functional microarrays, that allow the simultaneous analysis of
thousands of genes. However, most classical functional microarrays use specific probes that
monitor only known sequences and so, fail to cover the full microbial gene diversity present
in complex environments. We have thus developed a program, named Metabolic Design, to
design efficient explorative probes for functional microarrays. Then, we successfully
validated our new functional microarray studying metabolic capacities of Sphnigomonas
paucimobilis sp. EPA505 able to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. Finally, we
assessed metabolic capacities of microbial communities in soil, contaminated with aromatic
hydrocarbons. Results show that our probe design (sensitivity and explorative quality) can be
used to study a complex environment efficiently.
Keywords : functional microarray, polycyclic aromatic hydrocarbon, probe design,
explorative probe.

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