Table Of ContentMolekular-
und Zellbiologie
Aktuelle Themen
Herausgegeben von
N. Blin, M.F. Trendelenburg und E.R. Schmidt
Mit 52 Abbildungen
Springer-Verlag
Berlin Heidelberg New York Tokyo 1985
NIKOLAUS BUN, Institut fUr Humangenetik
UniversiHitsklinik Gebaude 68, Universitat des Saarlandes
6650 Homburg
MICHAEL F. TRENDELENBURG
Deutsches Krebsforschungszentrum, 1m Neuenheimer Feld 280
6900 Heidelberg
ERWIN R. SCHMIDT, Institut fUr Genetik
Ruhr-Universitat, Postfach 102148
4630 Bochum 1
CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek
Molekular-und Zellbiologie 1 hrsg. von N. Blin ... -
Berlin; Heidelberg; New York; Tokyo: Springer, 1984.
ISBN-13: 978-3-540-13934-8 e-ISBN-13: 978-3-642-70100-9
DOl: 10.107/978-3-642-70100-9
NE: Blin, Nikolaus [Hrsg.]
Das Werk ist urheberrechtlich geschiitzt. Die dadurch begriindeten Rechte, insbesondere die der
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Miinchen, wahrgenommen.
© by Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1985
Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk
berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daB solehe Namen im Sinne
der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten waren und daher von
jedermann benutzt werden diirften.
2131/3130-543210
Vorwort
Die vorliegende Themensammlung entstand aus Diskussionen
mit Studenten, die an Spezialkursen uber zell- und mole
kularbiologische Methodon teilnehmen und mit Kollegen,
die solche Kurse abhalten. Wir gewannen den Eindruck,
daB es gegenw~rtig relativ wenig gut zug~ngliche Litera
tur gibt, welche allgemeinverst~ndlich die breite Palet
te der aktuellen Themen und Methoden der Molekular- und
Zellbiologie behandelt. Bei der Vorbereitung des vorlie
genden Bandes haben wir vor allem auf die Aktualit~t der
Themen Wert gelegt und weniger eine Vollst~ndigkeit einer
Gesamtmonographie angestrebt. Auch wurde bewuBt darauf
verzichtet, detaillierte Arbeitsanleitungen zu vermitteln.
Aufgrund unseres personlichen wissenschaftlichen Engage
ments haben wir drei Schwerpunkte gesetzt (Charakteri
sierung spezieller Proteine; DNA Analyse; Funktionsun
tersuchungen an Genen und Chromosomen). Die Beitr~ge sind
so konzipiert, daB neben Spezialinformation auch Querver
bindungen zu Nachbargebieten und ubergreifenden Techniken
vermittelt werden sollten. Der Leser wird betont darauf
verwiesen auf solche Uberschneidungen zu achten, da sie
zu den Charakteristika der aktuellen biologischen For
schung gehoren.
Als Ergebnis entstand eine Sammlung von Kapiteln mit
zweierlei Akzentsetzung: einerseits Ubersichtsartikel
mit Allgemeindarstellung und punktuellen Beispielen (z.B.
DNA-Klonierung), andererseits Beitr~ge, die beispielhaft
ein System ausfuhrlicher belichten (z.B. Membranproteine
der Milchdruse).
Dieses Euch ist fur Studenten im fortgeschrittenen Se
mester konzipiert, die sich einen Einblick in eine Reihe
moderner Aspekte des weitumfassenden Gesamtkomplexes
Zell- und Molekularbiologie verschaffen wollen.
Die Herausgeber mochten an dieser Stelle allen an dem
Band beteiligten Kollegen herzlich fur ihre Mitarbeit
danken.
Heidelberg, im Oktober 1984 N. BLIN
M. TRENDELENBURG
E. SCHMIDT
Inhaltsverzeichnis
Funktionsanalyse zellularer Strukturproteine durch
Mikroinjektion
B.M. Jockusch und A. Flichtbauer (Mit 3 Abbildungen).
Methoden zur Charakterisierung von membranstandigen
Rezeptoren: Biochemische Charakterisierung und Rein
darstellung des Acetyl-LDL-Rezeptors von Makrophagen
H.A. Dresel, D.P. Via und G. Schettler
(Mit 2 Abbildungen)................................. 13
Isolation und Charakterisierung differenzierungs
spezifischer Antigene der Milchdrlise
E.-D. Jarasch, G. Bruder und H. Heid
(Mit 5 Abbildungen)................................. 22
Sequenzieren von DNA
E.R. Schmidt (Mit 5 Abbildungen) .................... 35
Mathematische und informationstheoretische Hilfs
mittel zur DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse
S. Suhai (Mit 5 Abbildungen) .......................• 52
Vektor-Wirt Systeme zur DNA-Klonierung in E. coli
W. Lindenmaier (Mit 3 Abbildungen) .................. 65
Zelloberflachenproteine - Klonierung ihrer Gene
durch DNA vermittelten Gentransfer und fluoreszenz
aktivierte Zellsortierung
R.K. Ball und B. Groner (Mit 2 Abbildungen) ......•.. 86
Linkshelikale Z-DNA: "DNA-Supercoiling" und Bindung
von Anti-Z-DNA Antikorpern
A. Nordheim (Mit 6 Abbildungen)..................... 93
Mikroklonierung von Chromosomenabschnitten
H. JackIe, V. Pirrotta und J.E. Edstrom
( Mit 5 Abbildungen) . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . • . . . • • .. 110
Molekular- und Cytogenetik sortierter Methaphasen
chromosomen
N. Blin (Mit 4 Abbildungen) ......................... 123
Chromosomenspezifische DNA-Bibliotheken in der
Humangenetik
T. Cremer und C. Cremer (Mit 3 Abbildungen) ......... 132
VIII
Gen-Injektion und Transkript-Analyse in der
Xenopus-Oocyte
A. Hofmann, A. Laier und M.F. Trendelenburg
(Mit 5 Abbildungen) ....................•.......•.•.. 144
Gentransfer in eukaryotische Zellen
H. Hauser ........................................... 159
SV40 als Modellsystem zum Studium eukaryontischer
Genregulation
K. Chowdhury, H. Scholer und P. Gruss
(Mit 4 Abbildungen) ...........................••...• 177
Hormonal gesteuerte Transkription - Definition der
regulatorischen Sequenz en im Genom des Maus-Mamma
tumorvirus
B. Groner (Mit 1 Abbildung) .....•................... 189
Sachverzeichnis .......................•............• 197
Mitarbeiterverzeichnis
Die Adressen der Mitarbeiter sind auf der jeweils ersten
Seite des betreffenden Beitrages zu finden.
Ball, R.K. 86 Jackie, H. 110
Blin, N. 123 Jarasch, E.-D. 22
Bruder, G. 22 Jockusch, B.M. 1
Chowdhury, K. 177 Laier, A. 144
Cremer, C. 132 Lindenmaier, w. 65
Cremer, T. 132 Nordheim, A. 93
Dresel, H.A. 13 Pirrotta, V. 110
Edstrom, J.E. 11 0 Schettler, G. 13
Flichtbauer, A. 1 Schmidt, E.R. 35
Groner, B. 86, 189 Scholer, H. 177
Gruss, P. 177 Suhai, S. 52
Hauser, H. 159 Trendelenburg, M.F. 144
Heid, H. 22 Via, D.P. 13
Hofmann, A. 144
Funktionsanalyse zelluIarer Strukturproteine durch
Mikroinjektion
B. M. Jockusch und A. Fuchtbauer
Lehrstuhl flir Entwicklungsbiologie, U niversitiit Bielefeld, D-4800 Bielefeld
Die Mikroinjektion geloster Substanzen in tierische Gewebekulturzellen
sowie in Oocyten hat in den letzten Jahren weite Verbreitung gefunden.
Mit Hilfe dieser Methode kann man rasch und mit groBer Ausbeute bio
logisch wichtige Makromoleklile wie z.B. DNA, mRNA oder Proteine, oder
auch kleinere Moleklile wie Hormone oder Salze in den Zellkern und in
das Zytoplasma einbringen, ohne die betroffenen Zellen zu schadigen.
Von der Flille der sich daraus ergebenden Anwendungsgebiete soll in
diesem Kapitel nur auf einen Teilaspekt naher eingegangen werden: die
Analyse von Zytoskelett-Strukturen durch Mikroinjektion von Proteinen
ins Zytoplasma von Gewebekulturzellen.
Etwa ein Drittel des Gesamtproteins tierischer Zellen wird zurn Aufbau
von Zytoskelett-Elementen verwendet. lnnerhalb des fibrillaren Zyto
skeletts kann man drei Systeme unterscheiden: Mikrotubuli, Mikrofila
mente und lntermediarfilamente, die sich in der Zusammensetzung ihrer
Proteinkomponenten, in ihrer Morphologie und ihrer Funktion voneinan
der unterscheiden. Das Mikrofilamentsystem besteht z.B. aus doppelhe
likalen Aktinfilamenten von etwa 40 A Durchmesser, die durch Asso
ziation mit einer Flille verschiedener Aktin-bindender Proteine unter
schiedliche supramolekulare, raurnliche und zeitliche Muster bilden
(vergl: Jokusch, 1983). Urn die Bedeutung solcher zellularer Strukturen
zu verstehen, ist daher eine Analyse sowohl der Verteilung als auch
der Funktion der einzelnen Bausteine wlinschenswert. Wahrend die Lo
kalisation durch spezifische Antikorper mit lmmunfluoreszenz und
lmmuno-Elektronenmikroskopie in den let"zten Jahren groBe Fortschritte
gemacht hat, ist unsere Kenntnis liber die Funktion vergleichsweise ge
ring. Die Hauptgrlinde daflir sind wohl folgende: (1) Die Reinigung vie
ler Einzelkomponenten mit gebrauchlichen biochemischen Methoden ist
schwierig, da sie oft nur in geringen Konzentrationen vorhanden und
sehr Proteolyse-empfindlich sind. (2) Aus in vitro-Analysen zur Funk
tion solcher Einzelkomponenten kann man nicht ohne weiteres auf die
Funktion in der lebenden Zelle schlieBen. Z.B. kann man die vermutete
lnteraktion eines gereinigten Strukturproteins mit Aktinfilamenten
durch viskosimetrische oder spektroskopische Methoden untersuchen. Es
fehlt hierbei aber das intrazellulare Milieu: in der Zelle werden
solche Wechselwirkungen wahrscheinlich durch die Kompetition anderer
Proteine urn dieselbe Bindungsstelle oder durch kontrollierte Anderung
des lokalen lonen-Milieus moduliert.
Die Mikroinjektion in das Zytoplasma von Einzelzellen, kombiniert mit
Fluoreszenzmarkierung von Proteinen umgeht diese Schwierigkeiten. Zur
Erhohung des intrazellularen Spiegels einer Strukturkomponente durch
Mikroinjektion z.B. genligen winzige Mengen gereinigten Materials, urn
einen tiefgreifenden Effekt zu erzielen, der Rlickschllisse auf die Funk
tion dieser Komponente zulaBt. Antikorper gegen dieselbe Komponente
konnen das injizierte Material in fixierten Zellen lokalisieren. In
jektion des Antikorpers in lebende Zellen kann durch Blockierung funk-
Molekular- und Zellbiologie
Hrsg. von Blin et al.
© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1985
2
tioneller Bindungsstellen, durch Aggregation von Strukturelementen
oder durch Prazipitation von Antigen-Antik6rperkomplexen selektiv zum
Ausfall einer Komponente flihren. In diesem Beitrag soll im folgenden
die Mikroinjektionsmethode beschrieben werden, so wie sie in verschie
denen Laboratorien flir solche Untersuchungen eingesetzt wird. Ergeb
nisse verschiedener Arbeitsgruppen werden als Beispiele kurz disku
tiert, um die Bedeutung der Methode zu illustrieren.
Methodik
InstY'UJ7/ente und Injektions-Teehnik. Zur Injektion in tierische Zellen hat
sich in den letzten Jahren in den meisten Labors die sogenannte
"Graessmann-Technik" durchgesetzt (Graessmann und Graessmann, 1976).
Dabei wird eine mit Fllissigkeit geflillte Mikrokapillare unter varia
blem Winkel von oben in Zellkultur-Zellen eingestochen, wobei die auf
Glas- oder Plastik-Plattchen kultivierten Zellen in einer offenen Kul
turschale im Medium verbleiben. Das Einstechen geschieht unter mikro
skopischer Kontrolle, die Injektion der Fllissigkeit erfolgt durch
Druckluft, die von hinten auf die Glaskapillare wirkt. Eine einfache
Apparatur dieser Art ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Invertmikro
skop erm6g1icht die Beobachtung des Einstechvorganges, der Mikromani
pulator ist zur Fein-Regulation der Position der Kapillare notwendig.
Bereits beim Eintauchen in das Medium wird mittels der Injektions
spritze auf die vorher geflillte Kapillare Druck ausgelibt ("Haltedruck").
Beim Durchstechen der Zellmernbran wird durch vorsichtiges Erh6hen des
Druckes auf die Injektionsspritze ("Injektionsdruck") ein Quantum
Fllissigkeit in die Zelle injiziert, die Kapillare wird unter dem glei
chen Druck aus der Zelle zurlickgezogen.
Von dieser ursprlinglichen "Graessmann-Apparatur" gibt es inzwischen
einige Varianten, bei denen die Druckluftzufuhr elektronisch geregelt
wird (z.B. Ansorge, 1982; Pochapin et al., 1983). Dies bringt den Vor
teil, daB stets gleich viel Druck bei jeder Injektion ausgelibt wird,
so daB man theoretisch mit gr6Berer Reproduzierbarkeit rechnen kann.
Unter Umstanden erweist es sich aber als wlinschenswert, mit variablem
Druck die Zellen "individuell" zu injizieren: wenn mit asynchronen
Zellkulturen gearbeitet wird, so kann man den unterschied in der Zell
masse auf diese Weise auszugleichen versuchen.
Flir die Mikroinjektion eignen sich Glaskapillaren mit Innenfilament,
wie sie flir die Elektrophysiologie von entsprechenden Firmen angeboten
werden. Zum Ausziehen der Kapillare kann ebenfalls ein kauflicher Na
delzieher benutzt werden, selbstgebaute Apparaturen sind unter Umstan
den den auf dem Markt angebotenen liberlegen, weil sie auf individuelle
Bedlirfnisse abgestirnrnt werden und hehere Ausbeuten an brauchbaren Mikro
kapillaren liefern kennen. In unserem Labor werden die Kapillaren mit
einem von einer Instituts-Werkstatt angefertigten Nadelzieher sehr fein
ausgezogen und unter mikroskopischer Kontrolle durch Abbrechen verklirzt,
wobei ein Spitzendurchmesser von ca. 1 vm angestrebt wird.
Diese Kapillaren kennen auf verschiedene Arten mit der Injektions
fllissigkeit geflillt werden: (1) Die Fllissigkeit wird in eine R6ntgen
kapillare eingesaugt und von hinten blasenfrei in die Mikrokapillare
eingespritzt. (2) Die Fllissigkeit steigt durch Kapillarkrafte in die
mit der Spritze eingetauchte Mikrokapillare auf. (3) Die Mikrokapillare
wird mit dem stumpfen Ende eingetaucht, durch das Innenfilament steigt
die Fllissigkeit langsam, aber blasenfrei bis in die vorderste Spitze;
AnschlieBend kann die Mikrokapillare mit feinen Kanlilen oder R6ntgen
kapillaren von hinten mit Paraffin61 aufgeflillt werden.
3
Abbildung 1. Einrichtung zur
Injektion in Gewebekultur
zellen. Das Invertmikroskop
liefert den zur Beobachtung
der Zellen vor, wahrend und
nach der Operation notigen
Arbeitsabstand. Die Glaska
pillare wird mit einem Mikro
manipulator geflihrt. Uber
eine einfache 50 ml Injektions
spritze (als Explosionsschutz
mit Klebeband umwickelt) wird
die Injektionsfllissigkeit in
der Kapillare unter "Halte
druck" in die Zelle einge
bracht, unter einem etwas
hoheren "Injektionsdruck" aus
der Kapillare in die Zelle
befordert
Zellen. Flir die Mikroinjektion eignen sich besonders Zellen, die sich
auf einem klinstlichen Substrat (Glas, Plastik, eventuell mit Matrix
Substanzen wie Collagen oder Fibronektin, Gelatine oder Polylysin be
schichtet) anheften. Unter den tierischen Gewebekulturzellen gehoren
dazu vor allem Bindegewebs- und Epithelzellen, sowie Carcinomzellen.
Die Haftung am Substrat muB der unter einem Winkel angreifenden Mikro
kapillare ausreichenden Widerstand entgegensetzen. Bei Bindegewebs
zellen wird dies wohl durch die direkt auf dem Substrat liegenden Haft
punkte ("Focal Contacts, Izzard und Lochner, 1976) erreicht, bei Epi
thelzellen zusatzlich noch durch interzellulare Verbindungen ("Junc
tions"). Carcinomzellen sind in Kultur haufig ebenfalls durch inter
zellulare Kontakte verbunden. AuBerdem entwickeln sich an ihrer Unter
seite groBflachig Bereiche, in denen die Zellmembran das Substrat zwar
nicht direkt berlihrt, aber sehr nahe daran herankommt und vermutlich
liber extrazellulare Matrix-Substanzen damit verbunden ist ("Close Con
tacts"). Zellen, die normalerweise in Suspension wachsen (z.B. Myelom
zellen, Leukamien, Aszites-Tumorzellen) konnen unter Umstanden durch
EingieBen in Weichagar arretiert werden. Die Mikroinjektion in solche
im dreidimensionalen Ve"rband wachsendeTl Zellen ist jedoch ungleich
schwieriger als in die "Monolayer"-Kulturen. Die Geometrie solcher
Zellen spielt bei der Mikroinjektion ins Zytoplasma ebenfalls eine
wichtige Rolle. Selbstverstandlich sind groBe Zellen leichter zu inji
zieren als kleine. Unglinstig sind sehr flach ausgebreitete Zellen, bei
denen die Zelldicke dicht neben dem Kern sehr scharf abfallt, so daB
man in extrem flachen Winkeln mit der Mikrokapillare herankommen muB.
