Table Of ContentMMOOLLEECCUULLAARR CCHHAARRAACCTTEERRIIZZAATTIIOONN
OOFF AARROOMMAATTIICC CCOOMMPPOOUUNNDD AANNDD
HHEEAAVVYY MMEETTAALL DDEETTOOXXIIFFIICCAATTIIOONN
SSYYSSTTEEMMSS IINN TTHHEERRMMOOPPHHIILLIICC
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IIMMPPAACCTT OONN BBIIOOMMOONNIITTOORRIINNGG AANNDD
BBIIOORREEMMEEDDIIAATTIIOONN
Immacolata Del Giudice
Dottorato in Scienze Biotecnologiche – XXV ciclo
Indirizzo Biotecnologie Industriali e Molecolari
Università di Napoli Federico II
Dottorato in Scienze Biotecnologiche – XXV ciclo
Indirizzo Biotecnologie Industriali e Molecolari
Università di Napoli Federico II
MMOOLLEECCUULLAARR CCHHAARRAACCTTEERRIIZZAATTIIOONN
OOFF AARROOMMAATTIICC CCOOMMPPOOUUNNDD AANNDD
HHEEAAVVYY MMEETTAALL DDEETTOOXXIIFFIICCAATTIIOONN
SSYYSSTTEEMMSS IINN TTHHEERRMMOOPPHHIILLIICC
MMIICCRROOOORRGGAANNIISSMMSS:: PPOOTTEENNTTIIAALL
IIMMPPAACCTT OONN BBIIOOMMOONNIITTOORRIINNGG AANNDD
BBIIOORREEMMEEDDIIAATTIIOONN
Immacolata Del Giudice
Dottoranda: Immacolata Del Giudice
Relatore: Prof.ssa Simonetta Bartolucci
Coordinatore: Prof. Giovanni Sannia
‘Le nostre valigie logore stavano di
nuovo ammucchiate sul marciapiede;
avevano altro e più lungo cammino da
percorrere. Ma non importa, la strada è vita.’
Jack Kerouac
Contents
Riassunto 1
Summary 7
Chapter 1 General introduction 8
Chapter 2 Identification and physicochemical, structural and functional 37
characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus P2
Chapter 3 Structural and functional characterization of TtArsC, a novel 59
arsenate reductase involved in arsenic detoxification in the
bacterium Thermus thermophilus HB27
Chapter 4 Characterization of a putative transcriptional regulator, TtSmtB, 79
involved in arsenic detoxification in the bacterium Thermus
thermophilus HB27
Chapter 5 General conclusion 94
List of talks and publications 99
RIASSUNTO
La diffusione nell’ambiente di sostanze tossiche, tra le quali arsenico e composti
aromatici, ed i loro effetti dannosi sulla salute umana rappresentano un serio
problema in molte aree del mondo. In Bangladesh, India, Vietnam e Nord America,
per esempio, milioni di persone sono esposte ogni giorno a livelli di arsenico nelle
acque potabili che oltrepassano i limiti imposti dalla ‘WHO’ (‘World Health
Organization’). Siti contaminati da composti aromatici sono diffusi in tutto il mondo,
per esempio, in Germania sono state individuate più di 1400 aree, deputate
all’estrazione carbonifera, contaminate da idrocarburi monoaromatici, policiclici
aromatici e composti fenolici; solo una piccola percentuale (20%) di queste aree è
stata presa in considerazione per opere di bonifica.
L’arsenico è un metalloide normalmente presente nell’ambiente, ma le attività umane
hanno contribuito al suo accumulo anomalo nella biosfera e, di conseguenza, al suo
inserimento nella catena alimentare dove ha provocato gravi danni a tutti gli
organismi viventi. Anche i composti aromatici hanno un’origine naturale, in quanto
possono derivare dalla degradazione di polimeri come la lignina, tuttavia,
dall’avvento dell’industrializzazione ad oggi, la loro concentrazione ambientale è
andata sempre più aumentando a causa del loro impiego nell’industria farmaceutica
e chimica, nei combustibili fossili e nei pesticidi.
Dato che alcuni di questi composti presentano una tossicità molto elevata, appare
evidente che è richiesto un attento monitoraggio dell’inquinamento dei suoli e delle
acque, sia per adottare politiche di prevenzione che azioni di ‘bioremediation’,
soprattutto in quelle zone altamente contaminate localizzate in prossimità di aree
industriali o in cui tali aree sono state dismesse. Negli ultimi anni, al posto delle
tradizionali metodiche chimiche per la determinazione della concentrazione
ambientale di inquinanti, ha trovato largo impiego l’utilizzo dei biosensori cellulari
come sistema di monitoraggio ambientale. Rispetto alle tecniche convenzionali,
questi ultimi offrono diversi vantaggi, quali la semplicità d’uso, la specificità, la
velocità, l’economicità e la possibilità di effettuare misure tossicologiche. I biosensori
cellulari sono microrganismi, geneticamente ingegnerizzati, dotati, solitamente, di un
plasmide contenente una fusione genica tra un promotore, sensibile alla sostanza da
monitorare, ed un gene reporter, codificante una proteina la cui espressione può
essere facilmente determinata. I geni reporter più frequentemente utilizzati sono
quelli codificanti la ‘green fluorescent protein’ (GFP), la β-galattosidasi o la luciferasi,
che possono essere rivelate mediante fluorescenza, saggi colorimetrici e
bioluminescenza, rispettivamente. Di recente è stato riportato l’utilizzo di un nuovo
gene reporter (crtA), codificante una proteina coinvolta nella biosintesi dei
carotenoidi, che permetterebbe di costruire biosensori cellulari basati su metodi di
rivelazione ad occhio nudo.
Ad oggi, il microrganismo più utilizzato come biosensore cellulare è stato Escherichia
coli e pochi tentativi sono stati fatti per usare microrganismi diversi ed, in ogni caso,
hanno sempre previsto l’utilizzo di mesofili. Data la loro resistenza a condizioni
ambientali estremamente sfavorevoli, un passo avanti nel design di sensori batterici
più stabili e più efficienti potrebbe venire dall’impiego di microrganismi estremofili.
A causa della resistenza delle loro molecole alle alte temperature, unita a quella ai
solventi organici, detergenti, estremi di pH ed agenti caotropici, tra i microrganismi
estremofili, quelli che hanno suscitato il maggiore interesse sono stati i termofili e gli
ipertermofili.
1
Al fine di caratterizzare i sistemi di detossificazione di composti aromatici e arsenico
ed individuare molecole termostabili e termoresistenti, da poter utilizzare nel
biomonitoraggio e nella bioremediation di tali composti, in questo lavoro di ricerca
sono stati utilizzati come organismi modello due microrganismi termofili: Sulfolobus
solfataricus P2 e Thermus thermophilus HB27.
Nella prima parte di questo lavoro è stata posta particolare attenzione alla
caratterizzazione del pathway di detossificazione dei composti aromatici (in
particolare benzaldeide e salicilato) e della sua regolazione in S. solfataricus. In uno
studio condotto precedentemente era già stato caratterizzato un meccanismo, basato
su un sistema trasportatore/regolatore, implicato nella detossificazione della
benzaldeide in questo organismo; in particolare, il regolatore BldR, appartenente alla
famiglia di regolatori trascrizionali MarR, è stato individuato come un attivatore
trascrizionale che, in presenza di benzaldeide, è in grado di attivare l’espressione di
una permeasi, capace di estrudere la benzaldeide all’esterno della cellula, e di una
alcool deidrogenasi, capace di mitigarne la tossicità andando a convertire la
benzaldeide nel corrispondente alcool.
In questo lavoro di tesi, è stata caratterizzata una nuova proteina, denominata BldR2,
anche esso appartenente alla famiglia MarR. Tali regolatori sono stati ampiamente
studiati al fine di comprendere le basi molecolari dei meccanismi di resistenza a
droghe e della risposta allo stress indotto da composti aromatici. Il regolatore
identificato, BldR2, è stato espresso in forma ricombinante in E. coli, purificato
all’omogeneità e caratterizzato strutturalmente e funzionalmente. La proteina si è
dimostrata capace di legarsi specificamente, come omodimero, alla sequenza
promotrice a monte del suo stesso gene; mediante un’analisi della sequenza
nucleotidica, unita ad esperimenti di DNAsi-I footprinting, è stato individuato, nella
regione di legame, un sito costituito da una sequenza pseudo palindromica di 8
coppie di basi separata da 3 nucleotidi da una palindrome perfetta di 8 coppie di
basi. Dato che questo sito si sovrappone agli elementi basali identificati del
promotore e che, da dati riportati in letteratura, i siti localizzati in questa regione sono
solitamente le sequenze riconosciute dai repressori trascrizionali, è stato ipotizzato
che BldR2 possa regolare la sua stessa espressione andando ad interferire con il
legame dei fattori basali (TBP and TFB). Inoltre, è stato dimostrato che la proteina è
capace di legare alcuni composti aromatici, come benzaldeide e salicilato, con
affinità micromolari e che, in seguito al legame con essi, perde l’affinità verso la sua
sequenza promotrice target in una maniera dipendente dalla concentrazione.
Salicilato e benzaldeide agiscono come effettori di diversi membri MarR, anche se
non è escluso che ligandi naturali a più alta affinità possano non essere stati ancora
individuati.
I risultati in vitro ottenuti per BldR2 sono stati in accordo con l’induzione in vivo
dell’espressione del gene bldR2 in seguito all’aggiunta di composti aromatici.
Dato che i geni codificanti molti membri MarR sono localizzati a monte o a valle dei
geni regolati, è stato studiato l’ambiente genomico di bldR2 e sono stati individuati
due geni, localizzati a monte di bldR2, codificanti due componenti di un sistema di
trasporto di peptidi antimicrobici. Mediante saggi EMSA è stata dimostrata la
capacità di BldR2 di legare il promotore a monte di questi geni, così come quello a
monte del gene adh, codificante l’alcool deidrogenasi, e dell’operone MarR-like,
codificante la proteina BldR e la permeasi, precedentemente citate. Il legame a
questi promotori avviene con affinità confrontabili a quella verso il promotore del suo
stesso gene. Dai dati emersi è stato possibile ipotizzare un ruolo di BldR2 nella
regolazione della risposta allo stress indotto da composti aromatici, anche se ulteriori
2
Description:saggio è stato seguito monitorando il decremento di assorbanza a 340 nm del. NADPH, consumato nella .. orange, respectively. (C) A stereo view of
