Microarrays y Biochips de ADN

56 Pages·2002·0.97 MB·Spanish

by  Genoma España

Microarrays
y Biochips de ADN
Informe de Vigilancia
Tecnológica
Microarrays
y Biochips de ADN
Informe de Vigilancia
Tecnológica
MICROARRAYS Y BIOCHIPS DE ADN
El presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sido
realizado en el marco del convenio de colaboración
conjunta entre Genoma España y la Fundación General
de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), entidad
que gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología
(CIBT), perteneciente al Sistema de Promoción Regional
de la Innovación MADRI+D.
Los autores de este informe agradecen la colaboración
ofrecida por toda la comunidad científica y empresarial
para la realización de este informe. Un especial
agradecimiento al Dr. Fernando Martín Sánchez (ISCIII),
Dra. Ana Dopazo (CNIO), Dr. Laureano Simón (Medplant
Genetics, S.L.), Dr. Juan Bernal (IIB), Dr. Juan Carlos
Tercero (Pharmagen, S.A.), Dr. Carlos Briones y
Dr. Victor Parro (Centro de Astrobiología),
a D. Pedro M. Franco de Sarabia (Biotools B&M Labs, S.A.),
Dr. José Manuel Guisan (CSIC), Dr. Joaquín Dopazo
(CNIO), Dr. José María Carazo (CNB-CSIC)
y Dr. Manuel Navarro (CIEMAT).
La reproducción parcial de este informe esta autorizada
bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:
Microarrays y Biochips de ADN, Informe de Vigilancia
Tecnológica. GENOMA ESPAÑA / CIBT-FGUAM.
Genoma España no se hace responsable del uso
que se realice de la información contenida
en esta publicación. Las opiniones que aparecen
en este informe corresponden a los expertos consultados
y a los autores del mismo.
© Copyright:Fundación Española para el Desarrollo
de la Investigación en Genómica y
Proteómica/Fundación General de la Universidad
Autónoma de Madrid.
Autores: Marta López (CIBT-FGUAM)
Paloma Mallorquín (CIBT-FGUAM)
Miguel Vega (Genoma España)
Referencia: GEN-ES02001
Fecha: Octubre 2002
Depósito Legal:M-52478-2002
ISBN: 84-607-6228-9
Diseño y realización:Spainfo, S.A.
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MICROARRAYS Y BIOCHIPS DE ADN
Índice de contenido
• RESUMEN EJECUTIVO 7
1. INTRODUCCIÓN 8
2. TECNOLOGÍAS DE MICROARRAYS 10
2.1. Tipo de Sonda 10
2.2. Marcaje de Sondas 11
2.3. Material de Soporte 14
2.4. Inmovilización de ADN 16
2.5. Fabricación 17
2.6. Escaneado y Software 21
2.7. Breves cuestiones técnicas 23
2.8. Últimas tendencias en desarrollos tecnológicos 24
3. APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 26
3.1. Monitorización de la Expresión Génica 27
3.2. Cribado de compuestos activos y validación de dianas terapéuticas 28
3.3. Farmacogenómica 30
3.4. Diagnóstico molecular 31
• Chips para identificación de SNPs 31
• Chips de caracterización genética 31
• Chips de detección de enfermedades infecciosas 32
4. ASPECTOS DE MERCADO: APLICACIÓN DE MICROARRAYS DE ADN
Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 34
4.1. Arrays de alta densidad 34
4.2. Arrays de media y baja densidad 35
4.3. Mercados: Affymetrix 36
4.4. Mercados: empresas que compiten con Affymetrix 38
4.5. Estrategias de desarrollo e implantación 40
4.6. Modelos de negocio 41
4.7. Tendencias: lab-on-a-chip 42
5
5. CASOS PRACTICOS 43
Caso Práctico 1: Biotools B & M Labs, S.A 43
Caso Práctico 2: Centro de Astrobiología, CSIC-INTA 44
Caso Práctico 3: PharmaGen S.A. 45
Caso Práctico 4: Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM 46
Caso Práctico 5: Medplant Genetics, SL 47
Caso Práctico 6: Instituto de Salud Carlos III 48
Caso Práctico 7: Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO, ISCIII) 49
6. CONCLUSIONES 50
ANEXO I: Breve glosario de términos en genómica 53
ANEXO II: Índice de Tablas, Cuadros y Figuras 54
ANEXO III: Referencias 55
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MICROARRAYS Y BIOCHIPS DE ADN
Resumen ejecutivo
Los microarrays de ADN y biochips se definen Respecto a los aspectos de mercado, no hay duda
como una matriz bidimensional de material que Affymetrix es el actual líder del mercado,
genético, que permite la automatización sobre todo en la venta de arrays de alta densidad
simultánea de miles de ensayos encaminados a para expresión génica. Sin embargo, y para la
conocer en profundidad la estructura y práctica clínica, donde se necesitan arrays de
funcionamiento de nuestra dotación genética, menor densidad y coste, existen otras compañías
tanto en los distintos estados de desarrollo como que hacen de la fiabilidad, rapidez y
patológicos del paciente. simultaneidad del ensayo, sus principales valores.
Hasta la fecha no puede establecerse un auténtico Las alianzas en este sector, con objeto de
estándar en microarrays de ADN, sino la compartir bases de datos, licencias de secuencias
coexistencia de distintas tecnologías con el mismo y tecnologías desarrolladas, son la constante del
fin: el análisis de la expresión y la variabilidad sector en EE.UU. Además, actualmente existe una
génica. La decisión final sobre la tecnología a auténtica carrera tecnológica entre las distintas
aplicar (ej. cDNA vs. Oligos; depósito vs. Síntesis empresas que fabrican microarrays o sus
in situ de sondas) dependerá de la aplicación u componentes, para posicionarse como líderes de
objetivo final del ensayo. este importante mercado de futuro.
Algunas tendencias de desarrollo prometedoras No obstante existen todavía importantes
pretenden eliminar el paso de amplificación de la dificultades para transferir los resultados
muestra e incluso la integración de todas las obtenidos con microarrays o biochips a la práctica
operaciones en un solo dispositivo (Lab-on-a chip clínica, es decir, para que los pacientes se
o LOAC). En este sentido, los principales motores beneficien de este desarrollo tecnológico. En este
de la nueva generación de microarrays y biochips contexto, quizás la dificultad más importante
serán la integración, la fiabilidad y la sensibilidad resida en la variabilidad de los resultados
del ensayo. obtenidos en los ensayos, si bien se está
realizando un importante esfuerzo para la
A continuación se enumeran las principales estandarización de los protocolos de ensayo,
aplicaciones de microarrays y biochips en salud como paso previo y necesario para obtener
humana: procedimientos y dispositivos clínicos fiables.
– Monitorización de la expresión génica.
– Cribado de compuestos activos y validación de
dianas terapéuticas.
– Farmacogenómica. Medicina personalizada.
– Diagnóstico molecular y prognosis de
enfermedades.
– Detección de agentes infecciosos.
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1. Introducción
A finales de los años 80 cuatro científicos,
Stephen Fodor, Michael Pirrung, Leighton Read y
Lubert Stryer desarrollaron una revolucionaria
tecnología para la determinación y cuantificación
de ADN en una muestra. Esta tecnología
desembocaría posteriormente en la primera
plataforma de microarrays de ADN, denominada
entonces GeneChip de Affymetrix.
La principal ventaja de esta novedosa tecnología
frente a los métodos tradicionales (Northern,
Southern, etc.), residía en la alta densidad de
integración (cantidad) de material biológico que
se consigue inmovilizar, es decir, la posibilidad de
analizar simultáneamente miles de genes.
Actualmente esta tecnología se está aplicando
entre otros al análisis de la expresión génica,
detección de mutaciones y polimorfismos,
secuenciación, seguimiento de terapia, medicina
preventiva, screening y toxicología de fármacos, y
diagnóstico molecular.
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MICROARRAYS Y BIOCHIPS DE ADN
DEFINICIÓN DE MICROARRAY O BIOCHIP
Una colección (array) de ADN consiste en un gran número de moléculas de ADN ordenadas sobre un
sustrato sólido de manera que formen una matriz de secuencias en dos dimensiones. Estos
fragmentos de material genético pueden ser secuencias cortas llamadas oligonucleótidos, o de mayor
tamaño, cDNA (ADN complementario, sintetizado a partir de mRNA), o bien productos de PCR
(replicación in vitro de secuencias de ADN mediante la reacción en cadena de la Polimerasa). A estos
fragmentos de ADN de una sola hebra inmovilizados en el soporte, se les denomina a menudo
“sondas”. Los ácidos nucleicos de las muestras a analizar se marcan por diversos métodos
(enzimáticos, fluorescentes, etc.) y se incuban sobre el panel de sondas, permitiendo la hibridación
(reconocimiento y unión entre moléculas complementarias) de secuencias homólogas. Durante la
hibridación, las muestras de material genético marcadas, se unirán a sus complementarias
inmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo la identificación y cuantificación del ADN presente
en la muestra (mutaciones, patógenos, etc.). Con posterioridad, el escáner y las herramientas
informáticas nos permiten interpretar y analizar los datos obtenidos.
Cuadro 1. Definición de microarray o biochip.
Clasificación
Características Nombre
de microarrays según:
• Oligonucleótidos. • Gene Chips.
• cDNAs. • cDNA Array.
Material inmovilizado
• Proteínas. • Protein Chip.
• Tejidos. • Tissue Chip.
Personalizado Arrayers
Diseño del array
o surtido
Industrial Cassettes
Alta: microarrays
Fabricación Densidad de integración
Baja: macroarrays
“in situ”
Impresión Generación de la sonda
“depositadas”
Soporte rígido
No poroso / Covalente
(Cristal y Plástico)
Soporte / Tipo de unión
Poroso / No covalente Membranas
• Secuenciación por hibridación.
• Chips de secuenciación.
• Detección de cambios en la
• Chips de hibridación
Aplicación expresión génica.
comparativa.
• Cuantificación de la expresión
• Chips de expresión.
génica.
Tabla 1. Criterios de clasificación en Biochips (adaptado de http://infobiochip.isciii.es).
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2. Tecnologías de microarrays
DISEÑO DE MICROARRAYS
TECNOLOGÍAS/
OPERACIONES A REALIZAR
TÉCNICAS A EMPLEAR
Elección del tipo de ADN Sondas, oligos, cDNA…
Marcaje de sondas o muestras Enzimático, fluorescente…
Material de soporte Vidrio, plástico, membranas…
Inmovilización de sondas Activa, pasiva, covalente…
Fabricación Impresión, síntesis in situ…
Detección de la hibridación Escáneres, fluorimetrías…
Procesamiento de datos Software
Fig.1. Operaciones y tecnologías necesarias para la elaboración de microarrays y biochips de ADN (elaboración propia).
2.1. Tipo de Sonda
El diseño de las sondas y su producción son
Ácido nucleico DIANA:
elementos clave a la hora de hacer posible la
Ácido nucleico procedente de la muestra
hibridación en el biochip. Sin la riqueza de
problema, cuya secuencia genómica se
conocimiento y datos de secuencias disponibles
pretende detectar.
en diversas bases de datos y proyectos
genómicos, la generación de estas sondas sería
SONDAS de hibridación:
imposible. Físicamente, las sondas tienen tres
Fragmentos de ácidos nucleicos marcados
formas diferentes: clones de cDNA, productos de
cuya secuencia es complementaria a la del
PCR, y oligonucleótidos.
ADN diana.
Las sondas basadas en clones se depositan en la
superficie del array en forma de fragmentos o bases. Las sondas consistentes en
genes completos generalmente procedentes de oligonucleótidos difieren de las anteriores en que
librerías génicas1. El tamaño de estas sondas el número de pares de bases es más limitado,
puede ser de varios cientos de pares de bases 20-25 para análisis de expresión diferencial y
hasta varias kilobases. Los productos de PCR hasta 100 para análisis de expresión génica.
consisten en fracciones de genes generados por
PCR procedentes de clones de cDNA, librerías
genómicas, o RNA. La longitud de estos
fragmentos suele ser de 200 a 500 pares de
1“International Nucleotide Sequence Database Collaboration” [engloba DNA Data Bank of Japan (DDBJ), European
Molecular Biology Laboratory (EMBL/EBI) Nucleotide Sequence Database, (GenBank, USA)].
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/collab
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MICROARRAYS Y BIOCHIPS DE ADN
2.2. Marcaje de Sondas
La detección de la hibridación entre las sondas de ADN inmovilizadas en el soporte y los fragmentos de
material genético de la muestra, requiere un marcaje previo para su posterior detección. Este marcaje
puede ser directo o indirecto:
MARCAJE DE SONDAS Y MUESTRAS PARA DETECCIÓN DIRECTA
Marcaje Lectura Características Ventajas Desventajas
• Las enzimas pueden
a
n confundirse con
maa alcalidasa) énica Sam eala rp cmoandueae sectnor anc olantacto epmnruezesimestnartase ,s na aeutnmiv laeasntando
EnziFosfatasy peroxi Cromog escuanpsztaimrza atdo ec c oarnob msuonorgbéenrico • erNele arccuetisidviodo asdd ea dufexolin liudasoroe. sd een
Ej. radiación. el proceso de
( detección.
o
v) a
sótopo Radiacti(Ej. P o el I33125 Auto-radiografí Sedraseedt rliiaaun cccsttooiuvrnrpoados ar.ma inos óleatc olupaloasr • rapdNeureoaotx eccsilteceiiacsv rinooóee snsdc. eeesnit ealn •• BRaadjaia rcetsivoilduacdió.n.
I
• No se necesitan
• Los escáneres
reactivos
necesarios para la
) auxiliares en el
uorocromoFluoresceína uorimetría Uflmduleunzeto demarirelam asnsrceitcneeraan deudtoexnar c aeiltomandigtoeitud • pdsGereronatecsnecibcsiiolói dnda.ed, • dccpAooerlgosmtuetdeocnu cocdeiesóel nnlpm eleáannstsetcaiarcyiroaoel.ecesn el
FlEj. Fl de onda. fuascoi,lidad de fluorescencia.
( • La señal se atenúa con
reproducibilidad,
el tiempo.
flexibilidad.
Tabla 2. Métodos de marcaje de ADN en microarray para detección directa (elaboración propia).
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