Kemik doku onarımı için hidroksiapatit/peptit amfifil bazlı nanokompozit doku iskelelerinin ...

199 Pages·2015·12.45 MB·English

by  Soner Çakmak

KEMİK DOKU ONARIMI İÇİN HİDROKSİAPATİT/PEPTİT
AMFİFİL BAZLI NANOKOMPOZİT DOKU İSKELELERİNİN
GELİŞTİRİLMESİ

DEVELOPMENT OF HYDROXYAPATITE/PEPTIDE
AMPHIPHILE BASED NANOCOMPOSITE SCAFFOLDS
FOR BONE TISSUE REPAIR

SONER ÇAKMAK

PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Tez Danışmanı

Hacettepe Üniversitesi
Lisansüstü Eğitim-Öğretim ve Sınav Yönetmeliği’nin
Nanoteknoloji ve Nanotıp Anabilim Dalı için Öngördüğü
DOKTORA TEZİ olarak hazırlanmıştır.

2015
ETİK

Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak
hazırladığım bu tez çalışmasında,
 tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi,
 görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak
sunduğumu,
 başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara
uygun olarak atıfta bulunduğumu,
 atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi,
 kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı,
 ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversitede veya başka bir üniversitede başka
bir tez çalışması olarak sunmadığımı

beyan ederim.

10/03/2015

SONER ÇAKMAK
ÖZET

KEMİK DOKU ONARIMI İÇİN HİDROKSİAPATİT/PEPTİT
AMFİFİL BAZLI NANOKOMPOZİT DOKU İSKELELERİNİN
GELİŞTİRİLMESİ

SONER ÇAKMAK
Doktora, Nanoteknoloji ve Nanotıp Anabilim Dalı
Tez Danışmanı: Prof. Dr. Menemşe GÜMÜŞDERELİOĞLU
Mart 2015, 182 sayfa
Bu çalışmanın bir bölümü, 112M442 No’lu TÜBİTAK Hızlı Destek Projesi ile
desteklenmiştir. Ayrıca, tezin sahibi Soner Çakmak’ın Amerika Birleşik Devletleri’nde
gerçekleştirdiği çalışmalar, Hacettepe Üniversitesi Uluslararası İşbirliği Destekleme Projesi
altında 13 G 602 003 No’lu proje ile desteklenmiştir. Sunulan tez çalışması kapsamında,
kemik ve osteokondral doku mühendisliğinde kullanılabilecek farklı içerikte
biyomalzemeler tasarlanmış, üretilmiş ve bu biyomalzemelerin etkinliği in vitro hücre
kültürü deneyleriyle incelenmiştir. Bu amaca yönelik olarak üretilen iki-fazlı peptit amfifil
(PA)/hidroksiapatit (HA) doku iskelesiyle kemik doku mühendisliği, üç-fazlı ipek-HA/ipe
k/PA doku iskelesiyle ise osteokondral doku mühendisliği çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
Kemik doku mühendisliği çalışmalarında kullanılan nanofiber yapıda HA matrisler
elektroeğirme yöntemiyle, arjinin-glisin-aspartik asit (RGD) taşıyan PA hidrojeller (PA-
RGD) ise kendiliğinden düzenlenme yöntemiyle üretilmiştir. Fourier transform kızıl ötesi
spektroskopisi (ATR-FTIR) ve X-ışını kırınımı (XRD) analizleriyle HA nanofiber matrisin
kimyasal yapısı doğrulanmıştır. Bu yapının yüksek kristaliniteye sahip olduğu görülmüş,
ayrıca içeriğinde bulunan CaCO nedeniyle saf HA’ya göre daha biyobozunur bir malzeme
3
olabileceği düşünülmektedir. Taramalı ve geçirimli elektron mikroskobu (SEM ve TEM)
analizleriyle HA nanofiberlerin 437 ± 64 nm çapa sahip oldukları görülmüştür. PA-RGD
hidrojellerin kendiliğinden düzenlenme ve jelleşme sonrası hücre dışı matris (ECM) yapısına
benzer nanofiber düzenlenme gösterdiği AFM analiziyle gösterilmiştir. Peptit nanofiberlerin
ortalama çapı, SEM görüntüleri üzerinden 100 ± 64 nm olarak hesaplanmıştır. Dairesel
dikroizm ve ATR-FTIR analizleriyle, nanofiber düzenlenmenin β-tabaka ikincil yapı
üzerinden gerçekleştiği ve biyoaktif sekans olan RGD’nin fiber yüzeyinde yerleştiği
bulunmuştur. İn vitro çalışmalarda, kemik öncülü MC3T3-E1 hücreleri PA-RGD jeller
içerisine enkapsüle edildikten sonra HA nanofiber matris bu jel içerisine yerleştirilerek
nanokompozit yapı oluşturulmuştur. Hücre proliferasyonu analiziyle, HA, PA-RGD ve PA-
i
RGD/HA doku iskelelerinin üçünde de 7. günden sonra hücre proliferasyonunun arttığı
görülmüş ve 18. günde en yüksek proliferasyonun PA-RGD jelde olduğu bulunmuştur.
Floresan mikroskobu ve SEM analizleriyle, hücrelerin her üç doku iskelesinde de
osteoblastik morfoloji gösterdikleri tespit edilmiştir. Alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi analiz
sonucuna göre, yapıya HA eklenmesiyle çok daha etkin bir osteojenik farklılaşma
gerçekleştiği sonucuna varılmıştır. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)
yöntemiyle bu malzemelerde bulunan hücrelerin erken dönem gen olan Alp ve geç dönem
genler olan osteokalsin (Ocn) ve kemik sialoprotein (Bsp) ekspresyonları incelenmiştir. Alp
ve Ocn ekspresyon seviyeleri bakımından kültür boyunca örnekler arasında bir fark
görülmemekle birlikte, 18. gündeki Bsp ekspresyon seviyesinin PA-RGD/HA nanokompozit
yapıda çok daha yüksek olması bu yapının osteojenik farklılaşmanın en önemli belirteci olan
kemik mineralizasyonunu diğer örneklere göre çok daha fazla desteklediğini göstermiştir.
Tüm bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, PA-RGD/HA nanokompozit doku iskelesinin
kemik doku mühendisliği uygulamalarında başarılı bir şekilde kullanılabileceği
görülmüştür.
Tezin ikinci kısmı olan osteokondral doku mühendisliği çalışmasında ise kemik kısmı
%6’lık (w/v) ipek doku iskelesinden, kıkırdak kısmı arjinin-glisin-aspartik asit-serin
(RGDS) içeren PA hidrojelden (PA-RGDS) ve kemik-kıkırdak ara yüzeyi olarak ise %4’lük
(w/v) ipekten oluşan üç-fazlı doku iskelesi tasarlanmıştır. Bu çalışmada ayrıca, kemik kısmı
için insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler (hBMSC) ve kıkırdak kısmı içinse
insan kondrositleri (hAC) kullanılmış ve ikili kültür ortamında bu hücrelerin birbirlerine olan
tropik etkileri incelenmiştir. %6’lık (w/v) ve %4’lük (w/v) ipek doku iskelelerinin gözenek
çapları sırasıyla 416 ± 87 ve 194 ± 67 µm olarak hesaplanmış ve biyouyumlulukları ve içsel
bağlantılı gözenekleriyle kemik ve ara yüzey için uygun yapılar olduğu görülmüştür.
hBMSC’ler ipek doku iskelesi içerisinde osteojenik ortamda ve kondrositler PA-RGDS
hidrojel içerisinde kondrojenik ortamda iki hafta boyunca kültüre edilmiş ve daha sonra bu
iki yapı aralarına %4’lük ipek iskele eklenerek birleştirilmiş ve osteokondral kokteyl
ortamında iki hafta daha kültüre edilmiştir. İkili kültür ortamındaki kondrositlerin
hBMSC’lere tropik etkisi, yüksek ALP aktivitesi ve runt-ilişkili transkripsiyon faktörü
(RUNX2), ALP, tip I kollajen (COLL I), BSP, osteopontin (OPN), OCN ekspresyon
seviyeleriyle ve kalsiyum içeriğiyle kendini göstermiştir. SOX9, agregan (AGC) ve tip II
kollajen (COLL II) ekspresyon seviyelerine bakıldığında, PA-RGDS hidrojellerde
kondrojenik farklılaşmanın pellet kültüre göre çok daha erken bir sürede gerçekleştiği fakat
7.günden sonra gen ekspresyonlarının pellet kültürle benzer olduğu görülmüştür. İkili kültür
kondrositler üzerinde herhangi bir tropik etki yaratmamış ve bu da kondrositlerin
farklılaşmasında TGF-β1’in ikili kültüre göre çok daha etkin olduğunu göstermiştir.
Histolojik boyamalar sonucunda ikili kültürde bulunan hBMSC’lerin doku iskelesi
gözeneklerini çok daha yoğun bir şekilde doldurduğu görülmüş ve Alizarin kırmızısı ve von
Kossa boyamalarında ikili kültürdeki hBMSC’lerin çok daha fazla ve yoğun mineralize
yapılar ürettiği belirlenmiştir. Ayrıca, ikili kültürde bulunan kondrositlerin PA-RGDS
hidrojeller içerisinde yoğun bir kıkırdak ECM’si ürettikleri de Alcian mavisi boyamalarıyla
gösterilmiştir. Elde edilen veriler, hBMSC’lerin pahalı büyüme faktörleri kullanılmadan ikili
kültür yöntemleriyle de çok etkin bir kemik yapı oluşturabileceğini ve ayrıca kondrositlerin
TGF-β1 yokluğunda bile kıkırdak matrisi üretebildiğini göstermiştir. Neticede, bu çalışmada
tasarlanan üç-fazlı doku iskelesinin, osteokondral doku hasarlarının tedavisi için klinikte
kullanılabilir bir malzeme olduğu sonucuna varılmıştır.

Anahtar Kelimeler: Kemik doku mühendisliği, hidroksiapatit, elektroeğirme, peptit
amfifil, RGD, osteokondral doku mühendisliği, ipek, hBMSC, kondrosit
ii
ABSTRACT

DEVELOPMENT OF HYDROXYAPATITE/PEPTIDE AMPHIPHILE
BASED NANOCOMPOSITE SCAFFOLDS FOR BONE TISSUE
REPAIR

SONER ÇAKMAK
Doctor of Philosophy, Department of Nanotechnology and Nanomedicine
Supervisor: Prof. Dr. Menemşe GÜMÜŞDERELİOĞLU
March 2015, 182 pages
A part of this study was supported by 112M442 TÜBİTAK Project and Soner Çakmak was
also supported by Hacettepe University Scientific Research Coordination Unit, under The
International Cooperation Programme with Project Number of 13 G 602 003 during his
studies in USA. In the present study, biomaterials with different contents were designed,
fabricated and tested in vitro by cell culture studies for bone and osteochondral tissue
engineering. For this purpose bone tissue engineering studies were carried out with biphasic
peptide amphiphile (PA)/hydroxyapatite (HA) scaffolds, whereas triphasic silk-HA/silk/PA
scaffolds were used for osteochondral tissue engineering studies.
For bone tissue engineering studies, HA matrices in nanofiber form were fabricated by
electrospinning method, while arginine-glycine-aspartic acid (RGD) bearing PA hydrogels
(PA-RGD) were prepared by self assembling technique. The chemical structure of HA
nanofiber matrix was verified by Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and
X-ray diffraction (XRD) analyses and it was determined that this structure had high
crystallinity and exhibited better biodegradability when compared to pure HA, depending on
its CaCO content. Scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM)
3
analyses demonstrated that HA nanofibers had an average diameter of 437 ± 64 nm. AFM
analysis showed that PA-RGD hydrogels underwent self assembly and exhibited nanofiber
organization similar to extracellular matrix (ECM) structure after gelation. The average
diameter of peptide nanofibers was calculated as 100 ± 64 nm by using SEM images.
Circular dichroism and ATR-FTIR analyses showed that nanofiber organization occurred
via β-sheet secondary structure and RGD was located on the nanofiber surface. For in vitro
studies, pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells were encapsulated in PA-RGD gels and following
this step; nanocomposite structures were fabricated by embedding HA nanofiber matrix
within this gel. It was seen that cell proliferation was increased on all of the three scaffolds;
HA, PA-RGD and PA-RGD/ HA scaffolds, after the 7th day and on the 18th day, the highest
proliferation was detected in PA-RGD gel by cell proliferation analysis. Fluorescence
iii
microscopy and SEM analyses demonstrated that cells exhibited osteoblastic morphology
on both scaffolds. Depending on the results of alkaline phosphatase (ALP) activity analysis,
it was seen that the osteogenic differentiation was enhanced by the addition of HA to the
scaffold structure. By real time polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis, the expression
of Alp gene of cells was investigated as an early marker, while osteocalcin (Ocn) and bone
sialoprotein (Bsp) gene expressions of cells were analyzed as late markers of osteogenic
differentiation. Although no differences in Alp and Ocn expressions were detected among
the samples throughout the cell culture period, significantly higher expression of Bsp on PA-
RGD/HA nanocomposite on the 18th day showed that bone mineralization, which is an
important indication of osteogenic differentiation, was supported more by this scaffold.
Consequently, it was evaluated that PA-RGD/HA nanocomposite scaffold could be
successfully used in bone tissue engineering applications.
In the osteochondral tissue engineering study as the second part of the present work, silk
scaffolds from 6% (w/v) solution was used as the bone part and arginine-glycine-aspartic
acid-serine (RGDS) containing PA hydrogel (PA-RGDS) was used as the cartilage part,
while silk scaffolds from 4% (w/v) solution was designed as the bone-cartilage interface. In
addition to that, for the bone part of the scaffold human bone marrow derived mesenchymal
stem cells (hBMSCs) was used, whereas human chondrocytes (hAC) were used as cell
source for the cartilage part and the trophic effects of these two cells on each other were
investigated under co-culture conditions. The pore sizes of the silk scaffolds with 6% (w/v)
and 4% (w/v) silk contents were calculated as 416 ± 87 and 194 ± 67 µm, respectively and
it was seen that the silk scaffolds had suitable properties for bone and interface tissues due
to their biocompatibility and interconnected pore structures. Human BMSCs were cultured
on silk scaffolds in osteogenic medium and chondrocytes were cultured on PA-RGDS in
chondrogenic medium for two weeks. Following this culture period, these two cell seeded
scaffolds were combined together by placing the 4% (w/v) silk scaffold in between and the
resulting structure was cultured for an additional two weeks in the osteochondral cocktail
medium. The trophic effects of chondrocytes, which were cultured in the coctail medium,
on hBMSCs were revealed as enhanced expression of runt related transcription factor
(RUNX2), ALP, collagen type I (COLL I), BSP, osteopontin (OPN) and increased calcium
content. When the expression levels of SOX9, agregan (AGC) and collagen type II (COLL
II) were evaluated, it was seen that the chondrogenic differentiation of chondrocytes in PA-
RGDS hydrogels occurred significantly earlier than pellet cultures. However, gene
expressions in hydrogels were found to be similar to that of pellet cultures after the 7th day
of incubation. No significant trophic effect of coculture on chondrocytes was determined
and this finding showed that TGF-β1 had stronger influence on the chondrocyte
differentiation over the co-culture. By histology stainings, it was seen that the hBMSCs in
co-culture intensely filled the pores of the scaffold and it was seen that these cells also
produced higher amounts of denser mineralized structures detected by Alizarin red and von
Kossa stainings. Besides, densely production of cartilage ECM by the chondrocytes in co-
culture on PA-RGDS hydrogels was shown by Alcian blue staining. The findings of this
study has shown that hBMSCs could able to form an enabled bone structure by co-culture
technique without the use of expensive growth factors and chondrocytes could produce
cartilage matrix even in the absence of TGF-β1. As a result, it was concluded that the
triphasic scaffold designed in this study was a promising biomaterial which could be used
for the treatment of osteochondral tissue defects in clinic.

Keywords: Bone tissue engineering, hydroxyapatite, electrospinning, peptide amphiphile,
RGD, osteochondral tissue engineering, silk, hBMSC, chondrocyte
iv
TEŞEKKÜR

Hacettepe Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü Lisans öğrencisiyken bitirme ödeviyle
başladığım akademik hayatımın başlangıcından bugünlere kadar beraber çalışma fırsatı
bulduğum, bana akademik disiplini ve sistematiği öğreten, tez çalışmalarım sırasında
zamanını ve emeğini esirgemeyen, iyi-kötü anlarımda beni her zaman destekleyen Sayın
Hocam Prof. Dr. Menemşe Gümüşderelioğlu’na sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Tez çalışmalarımın bir kısmını, 112M442 No’lu Hızlı Destek Projesiyle destekleyen
TÜBİTAK’a, A.B.D.’de Tufts Üniversitesi, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü’nde
gerçekleştirdiğim bilimsel çalışmalarımı, Uluslararası İşbirliği Geliştirme Programı
çerçevesinde 13 G 602 003 No’lu Proje ile destekleyen üniversitem, Hacettepe
Üniversitesi’ne teşekkürlerimi sunarım.
Tufts Üniversitesi, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü’ndeki çalışmalarımın
gerçekleştirilmesinde gereken desteği sağlayan Bölüm Başkanı Prof. Dr. David L. Kaplan’a
ve araştırma grubuna teşekkür ederim. Bu süreçte Tufts Üniversitesi’nde güzel anlar
paylaştığım ve orada bulunduğumuz sürede dostluklarını esirgemeyen sevgili arkadaşlarım
Sezin Yiğit’e, Nikos Dimitrakakis’e, Mustafa Bozkurt’a, Joana’ya ve Esra-Özgür
Altınok’lara teşekkür ederim.
Hücre ve Doku Mühendisliği Araştırma Laboratuvarında, sadece iş arkadaşı olarak değil,
yakın dost olarak da çok güzel günler paylaştığım sevgili arkadaşlarım, Dr. Işıl Gerçek
Beşkardeş’e, Tuğrul Tolga Demirtaş’a, Ekin Özge Tunçay’a, Damla Çetin Altındal’a,
Yurtsever çifti Merve ve Arda’ya, Dr. Murat Şimşek’e ve tüm diğer değerli laboratuvar
arkadaşlarıma teşekkürlerimi borç bilirim. Ayrıca değerli dostlarım, Ayhan Varol’a, Şükrü
Ahmet İlhan’a, Dr. Uğur Sadioğlu’na, Dr. Halil Murat Aydın’a, Dr. Cem Bayram’a, Dr.
Tamer Çırak’a, Tayfun Vural’a ve tüm Hacettepe Kamu Futbol Takımı arkadaşlarıma,
destekleri ve arkadaşlıkları için çok teşekkür ederim.
Tüm hayatım boyunca beni destekleyen, kendi ayaklarım üzerinde durmayı öğreten,
sevincimi ve üzüntümü paylaştığım anneme, babama, abime, kardeşime, yeğenime, kısaca
Çakmak ailesine minnettarım, iyi ki varsınız. Hayatıma son yıllarda giren ve iyi ki varsınız
dediğim Emine Annem’e, Ceren’e, Kara ve Kahraman ailelerine, kuzenler The Kurul’a çok
teşekkürler.
Hayatımın neşesi, varlığıyla beni çok mutlu eden, her zaman desteğim, birtanem, bu tezin
ve ailemizin inşasında çok büyük emekleri olan, tanıştığım anda bundan sonra hayatımı
beraber geçirmeliyim dediğim kadın, Anıl Sera Çakmak, seni çok seviyorum ve geçirdiğimiz
her an için sana çok çok teşekkür ediyorum.
v
İÇİNDEKİLER
ÖZET ..................................................................................................................................... i
ABSTRACT ........................................................................................................................ iii
TEŞEKKÜR ......................................................................................................................... v
İÇİNDEKİLER ................................................................................................................... vi
SİMGELER VE KISALTMALAR ................................................................................... xi
1. GİRİŞ ................................................................................................................................ 1
2. GENEL BİLGİLER ........................................................................................................ 4
2.1. Kemik Doku Mühendisliği ............................................................................................. 4
2.1.1. Kemiğin Yapısı ve Özellikleri ..................................................................................... 4
2.1.2. Kemik Mikro ve Nano Mimarisi ................................................................................. 5
2.1.3. Kemik Hücreleri ve Yeni Kemik Oluşumu ................................................................. 7
2.1.4. Kemik Doku Mühendisliği Yaklaşımı ......................................................................... 9
2.2. Hidroksiapatit (HA) ve HA’nın Kemik Doku Mühendisliği’ndeki Kullanımı ............ 14
2.2.1. Geleneksel HA Sentez Yöntemleri ............................................................................ 14
2.2.1.1. İkili kimyasal çöktürme .......................................................................................... 14
2.2.1.2. Katı-faz reaksiyonu................................................................................................. 15
2.2.1.3. Hidrotermal sentez .................................................................................................. 15
2.2.1.4. Sol-jel yöntemi ....................................................................................................... 15
2.2.2. Elektroeğirme ile HA Üretimi ................................................................................... 18
2.2.2.1. Elektroeğirme yöntemi ........................................................................................... 18
2.2.2.2. Elektroeğirme ile seramik nanofiber üretimi .......................................................... 20
2.2.2.3. Elektroeğirme ile üretilen HA nanofiberlerin doku mühendisliği uygulamaları .... 22
2.3. Peptit Amfifiller ve Doku Mühendisliği ....................................................................... 23
2.3.1. Peptit Amfifillerin Yapısı ve Özellikleri ................................................................... 23
2.3.2. Peptit Amfifillerin Doku Mühendisliği Uygulamaları .............................................. 25
vi
2.4. Osteokondral Doku Mühendisliği ................................................................................ 27
2.4.1. Osteokondral Doku Yapısı ve Özellikleri ................................................................. 27
2.4.1.1. Zonal kıkırdak ........................................................................................................ 27
2.4.2. Osteokondral Hasarlar ............................................................................................... 30
2.4.3. Osteokondral Hasarların Tedavisi ............................................................................. 32
2.4.3.1. Klinik yöntemler ..................................................................................................... 32
2.4.4. Osteokondral Doku Mühendisliği Yöntemleri .......................................................... 35
2.4.4.1. Tek fazlı doku iskeleleri ......................................................................................... 37
2.4.4.2. İki-fazlı ve çok fazlı doku iskeleleri ....................................................................... 39
2.4.4.3. Osteokondral doku mühendisliğinde kullanılan büyüme faktörleri ....................... 44
2.4.4.4. Osteokondral doku mühendisliğinde kullanılan hücreler ve hücre seçimi ............. 45
3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR ....................................................................................... 49
3.1. Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Kimyasallar ........................................................... 49
3.2. Çalışmalarda Kullanılan Biyomalzemelerin Üretimi ................................................... 51
3.2.1. HA Nanopartiküllerin Sol-Jel Yöntemiyle Sentezlenmesi ........................................ 51
3.2.2. HA Nanofibröz Doku İskelelerinin Üretimi .............................................................. 52
3.2.3. Peptit Amfifillerin Sentezi ve Jelleştirilmesi ............................................................. 53
3.2.4. İki fazlı PA-RGD/HA Nanokompozit Doku İskelelerinin Üretimi ........................... 54
3.2.5. İpek Doku İskelelerinin Üretimi ................................................................................ 54
3.3. Karakterizasyon Çalışmaları......................................................................................... 55
3.3.1. X-ışını kırınımı (XRD) Analizi ................................................................................. 55
3.3.2. Fourier transform kızılötesi spektroskopisi (ATR-FTIR) Analizi ............................. 56
3.3.3. Termogravimetrik Analiz (TGA) .............................................................................. 56
3.3.4. Gözeneklilik Ölçümleri ............................................................................................. 56
3.3.5. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Analizi ......................................................... 57
3.3.6. Geçirimli Elektron Mikroskobu (TEM) Analizi ........................................................ 57
vii
3.3.7. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) Analizi ............................................................ 58
3.3.8. Dairesel Dikroizm (CD) Analizi................................................................................ 58
3.4. Hücre Kültürü Çalışmaları............................................................................................ 58
3.4.1. İki Fazlı Hidroksiapatit/Peptit Amfifil Nanokompozit Doku İskeleleri ile İn Vitro
Kemik Doku Mühendisliği Çalışmaları ............................................................................... 58
3.4.1.1. Hücre ekimi ............................................................................................................ 59
3.4.1.2. MTT analizi ............................................................................................................ 59
3.4.1.3. Mikroskobik görüntüleme ...................................................................................... 60
3.4.1.4. Alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi ............................................................................ 60
3.4.1.5. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile gen ifadesi analizi..... 61
3.4.2. Üç Fazlı İpek-Hidroksiapatit/Peptit Amfifil Nanokompozit Doku İskeleleri ile İn Vitro
Osteokondral Doku Mühendisliği Çalışmaları .................................................................... 62
3.4.2.1. hBMSC’lerin izolasyonu ........................................................................................ 62
3.4.2.2. hBMSC’lerin karakterizasyonu .............................................................................. 63
3.4.2.3. İnsan kökenli kondrositler ...................................................................................... 64
3.4.2.4. Hücre ekimi ............................................................................................................ 64
3.4.2.5. Üç fazlı osteokondral doku iskelesinin oluşturulması ............................................ 66
3.4.2.6. Hücre proliferasyonunun belirlenmesi ................................................................... 66
3.4.2.7. Hücre farklılaşmasının belirlenmesi ....................................................................... 67
3.4.2.8. Morfolojik analizler ................................................................................................ 69
3.3. İstatistiksel Analiz ........................................................................................................ 70
4. DENEYSEL SONUÇLAR VE TARTIŞMALAR ....................................................... 71
4.1. İki Fazlı Hidroksiapatit/Peptit Amfifil Nanokompozit Doku İskeleleri ile İn Vitro Kemik
Doku Mühendisliği Çalışmaları........................................................................................... 71
4.1.1. Çalışmalarda Kullanılan Malzemelerin Üretimi ve Karakterizasyonu...................... 72
4.1.1.1. Hidroksiapatit nanopartiküllerin sol-jel yöntemiyle sentezlenmesi ....................... 72
4.1.1.2. HA nanofibröz doku iskelelerinin üretimi .............................................................. 75
viii