Investigation of Microtubule Motility Driven by Membrane-Anchored Motor Proteins

96 Pages·2010·5.86 MB·English

by  Janine Fischer

DIPLOMARBEIT
zur Erlangung des akademischen Grades
Diplom-Physiker
Investigation of Microtubule Motility
Driven by Membrane-Anchored
Motor Proteins
vorgelegt von
Janine Fischer
geb. am 23.09.1985 in Magdeburg
angefertigt am
Max-Planck-Institut für Zellbiologie und Genetik, Dresden
Arbeitsgruppe Molekularer Transport
—
Fachrichtung Physik
Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften
Technische Universität Dresden
2010
Betreuer: Dr. Stefan Diez
1. Gutachter: Prof. Dr. Petra Schwille
2. Gutachter: Prof. Dr. Jonathon Howard
Eingereicht am: 12. Mai 2010
Eigenständigkeitserklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter
und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus
fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich
gemacht. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder
ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Dresden, 12. Mai 2010
Janine Fischer
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Zusammenfassung
Molekulare Motoren sind Proteine eukaryotischer Zellen, die chemische Energie aus der
Hydrolyse von ATP direkt in mechanische Arbeit umwandeln können. Ein solcher Motor
ist Kinesin-1, welches innerhalb der Zelle für den aktiven Transport von membranum-
schlossenen Transportgütern wie Organellen oder synaptischen Vesikeln zuständig ist.
Zur Untersuchung der Kinetik dieser Motoren unter kontrollierten Bedingungen eig-
nen sich zellfreie Minimalsysteme. Viele dieser in-vitro-Studien beschreiben die Kraft-
übertragung einzelner Kinesin-1-Motoren, die mit ihrer Schwanzregion fest an künstli-
che Transportgüter oder an eine Substratoberfläche gebunden sind und sich mit ihrer
funktionellen Einheit entlang von rekonstituierten Mikrotubulifilamenten fortbewegen.
Weniger experimentelle Daten gibt es dagegen über das Kollektivverhalten mehrerer
Motoren. Dabei sind insbesondere die Transporteigenschaften von membranständigen
Motoren interessant, wie es für die Ladungsbeförderung in Zellen von Bedeutung ist.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht nun die Frage, ob effektiver Trans-
port durch mehrere Kinesin-1-Motoren möglich ist, wenn diese, entsprechend der in-
vivo-Situation beim Transport großer Organellen, diffusiv in einer planaren Doppel-
lipidschicht verankert sind. Um dieses Szenario nachzubilden wurden GFP-markierte
Kinesin-1 Motorproteine über eine Biotin-Neutravidin-Bindung in Lipiddoppelschichten
auf einer Oberfläche verankert und die Lipid-/Kinesindiffusion mit Photobleaching-/
Einzelmolekülmethoden analysiert. Bei hohen Motordichten wurden Gleitgeschwindig-
keiten von Mikrotubuli untersucht.
Eswurdefestgestellt,dassdieGleitgeschwindigkeitenauf45%fürsehrhohebzw.67%
für mittelhohe Motordichten gegenüber Experimenten mit festem Kinesin reduziert sind.
Außerdem wurde ein theoretisches Modell zur Beschreibung des Aufbaus entwickelt, das
die verringerten Gleitgeschwindigkeiten durch Diffusion des Lipidankers erklärt. Deswei-
teren kann aus der Geschwindigkeitsabnahme die Anzahl der wechselwirkenden Motoren
pro Mikrotubulilänge vorhergesagt werden.
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Abstract
Molecular motors are proteins that are able to convert the chemical energy gained from
the hydrolysis of ATP into mechanical work. Among them, kinesin-1 is involved in long-
range transport of membrane-enclosed cargo, such as organelles or synaptic vesicles.
The kinetic properties of single kinesin-1 motors have been extensively studied under
controlled in vitro conditions, where the motors are rigidly attached to an artificial cargo
ortoasubstratesurface,interactingwithmicrotubulefilaments. Lessisknownaboutthe
forcegenerationofmultiplemotorsactinginconcert. Especially, thecollectivebehaviour
of multiple membrane-associated motors is of current interest, such as it known to occur
during the transport of membrane-enclosed cargo in vivo.
Thepresentstudyasks,ifeffectivetransportbymultiplekinesin-1ispossiblewhenthe
motorsareanchoredtoaplanarlipidbilayerinadiffusivemanner. Thisisthecaseduring
the transport of large organelles in cells. In order to mimic such a scenario, kinesin-1
motor proteins were anchored to planar supported lipid bilayers via a biotin-neutravidin
linkage. The diffusive behaviour of lipid and GFP-labelled kinesin-1 molecules was
identified using photobleaching and single molecule imaging techniques, respectively. At
high motor density, gliding motion of reconstituted microtubules driven by membrane
anchored gliding motor proteins was observed.
It was found that the microtubule gliding velocities are decreased to about 67% for
very high and 45% for medium high motor density, compared to assays where the mo-
tors were rigidly attached to surface-immobilised antibodies. Furthermore, a theoretical
model was established for this setup, that describes the decreased gliding velocities as a
consequence of the diffusive anchorage of the motors in the lipid bilayer. Additionally,
the model allows for a prediction of the number of motor proteins interacting with the
microtubule per unit length from the decline of the microtubule velocity.
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Contents
Abbreviations and Symbols xi
1 Introduction 1
2 Basic Principles 7
2.1 Cargo Transport by Kinesin-1 Motor Proteins . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.2 Lipid Bilayer Systems and Diffusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3 Fluorescence Microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3 Theoretical Considerations 29
3.1 Nanoscopic Setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.2 Membrane-Anchored Gliding Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.3 Consequences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4 Materials and Methods 37
4.1 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.2 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.3 Optical Setup and Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
5 Results and Discussion 51
5.1 Generation of Supported Lipid Bilayers and Lipid Diffusion . . . . . . . . 52
5.2 Diffusion of Membrane-Anchored Kinesin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.3 Microtubule Motility Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
6 Conclusion and Outlook 71
Bibliography 74
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