Interferenzen endokrin aktiver Substanzen mit der Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsenachse

259 Pages·2010·4.43 MB·German

by  Inka Gotthardt

Charité - Universitätsmedizin Berlin
Institut für Experimentelle Endokrinologie
Interferenzen endokrin aktiver Substanzen mit der
Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsenachse
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat)
im Fach Biologie
eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Dipl.-Biologin Inka Gotthardt, geb. Hamann
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter

Prof. Dr. Werner Kloas
Prof. Dr. Josef Köhrle
Prof. Dr. Hubertus Jarry
Datum der mündlichen Prüfung: 30.06.2009

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Endokrin aktive Substanzen (EACs) sind exogene Substanzen natürlichen oder
synthetischen Ursprungs, die mit der Feedbackregulation hormoneller Netzwerke
interferieren können und somit deren Homöostase beeinflussen. Störungen der
Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsenachse (HPT-Achse) haben weitreichende
Konsequenzen, da Schilddrüsenhormone essentiell für die Regulation von
Entwicklung, Wachstum und Stoffwechsel sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Wirkprofil potenter Inhibitoren der thyreotropen
Achse am Beispiel von 4-Methylbenzyliden-campher (4-MBC) und Genistein (GEN)
untersucht. Der UV-Filter 4-MBC wurde in der ovariektomierten Ratte als goitrogene
Substanz identifiziert. 4-MBC interferiert auf Ebene von Hypothalamus und Hypophyse
mit der Expression Feedback-assoziierter Gene und beeinflusst daher die
Feedbackregulation der thyreotropen Achse. Darüber hinaus wird die Biosynthese von
Schilddrüsenhormonen durch Inhibition des Iodidtransports bei gleichzeitig erhöhter
messenger RNA (mRNA)-Konzentration des Natrium-Iodid-Symporters (NIS) durch
4-MBC beeinträchtigt. Parallel dazu lässt die verstärkte Expression des
Angiogenesemarkers vascular endothelial growth factor (VEGF) nach subakuter
Exposition auf die Entstehung einer Hypothyreose schließen. Die damit
einhergehenden Veränderungen sind auch in peripheren Organen durch die Analyse
3,3‘,5-Triiod-L-thyronin (T )-regulierter Zielgene dokumentiert. Zudem wurden diese
3
Effekte maßgeblich durch die Expositionszeit beeinflusst, da nach chronischer
Exposition vermutlich auch kompensatorische Prozesse eine wichtige Rolle spielen.
Die gezeigten speziesspezifischen Effekte lassen sich möglicherweise auf
Unterschiede in der Pharmakokinetik zurückführen, z.B. in Folge differentieller
Expression von Cytochrom P450-Genen. Die mechanistische Analyse des Wirkprofils
von GEN, das unter anderem in Soja und Rotklee enthalten ist, erfolgte in
Schilddrüsenhormonrezeptor (TR)-defizienten Mäusen (TRα0/0). Abhängig vom
Geschlecht konnten gewebespezifische Effekte von GEN nachgewiesen werden, die
aber keinem offensichtlichen Muster folgten und somit weiterführende Untersuchungen
erfordern.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass EASs in Konzentrationen, die bislang als
unbedenklich eingestuft wurden, sowohl die Funktion als auch die Regulation der HPT-
Achse beeinträchtigen.
I
Zusammenfassung

Endokrin aktive Substanz (EAC
UV-Filter
4-Methylbenzyliden-campher (4-MBC
Soja
(Iso-)Flavonoide
Genistein (GEN)
F21388
Schilddrüse
5‘-Deiodasen
Natrium-Iodid-Symporter (NIS)
II
Summary
Summary
Endocrine active compounds (EACs) can be of natural or synthetic origin and show
hormone-like effects that interfere with feedback regulation of hormonal networks.
Interferences with the hypothalamic-pituitary-thyroid axis (HPT-axis) result in extensive
consequences as thyroid hormones are essential for regulation of development,
growth, and metabolism.
In the work presented here, the active profile of potent inhibitors of the HPT-axis
namely 4-methylbenzylidene-camphor (4-MBC) and genistein (GEN) was investigated.
4-MBC, a UV filter used in sunscreens and various cosmetics, was identified as a
goiter causing agent using ovariectomized rats. 4-MBC acts at the level of
hypothalamus and pituitary gland by modulating the expression of thyrotropin-releasing
hormone (TRH) as well as thyroid-stimulating hormone (TSH) that regulate feedback
on the HPT-axis. Furthermore, biosynthesis of thyroid hormones was impaired by
4-MBC secondary to the inhibition of iodide transport with concomitantly increased
messenger RNA (mRNA)-levels of the sodium-iodide symporter (NIS). In parallel
expression of the angiogenesis marker vascular endothelial growth factor (VEGF) was
increased, indicating hypothyroidism. After the application of 4-MBC the expression of
L-3,3’,5-triiodothyronine (T )-regulated target genes was reduced in the periphery both
3
on the mRNA and protein level. The documented species-specific effects indicate a
difference in pharmacokinetics, possibly secondary to differential expression of
cytochrome P450 genes. GEN is contained in soy and red clover and its mechanistic
analysis was carried out in thyroid hormone receptor (TR) deficient mice (TRα0/0). The
gender-dependent effects of GEN on tissue specificity did not follow an obvious pattern
and warrant continuative analysis.
The work presented here supports the assumption that EACs can interfere with
function and regulation of the HPT-axis at levels that were previously considered safe.
III
Summary

endocrine active compound (EAC
UV filter
4-Methylbenzylidene-camphor (4-MBC
Soy
(iso-)flavonoids
genistein (GEN)
F21388
thyroid gland
5’-deiodinases
sodium-iodide symporter (NIS)
IV
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Experimentelle Endokrinologie der
Charité - Universitätsmedizin Berlin angefertigt und durch die Europäische Union im
Rahmen des Projektes „EURISKED - Multi-organic Risk Assessment of selected
Endocrine Disrupters“ (Grant-Nr. EKV1-CT-2002-00128) sowie durch ein
Promotionsstipendium der Charité - Universitätsmedizin Berlin gefördert.
V
Danksagung
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. J. Köhrle nicht zuletzt für die Bereitstellung
des interessanten und vielschichtigen Themas meiner Dissertation, sondern vor allem
für seine ausgezeichnete wissenschaftliche Betreuung und die konstruktiven
Diskussionen im Verlauf meiner Doktorarbeit am Institut für Experimentelle
Endokrinologie. Weiterhin möchte ich mich auch für die zahlreichen Gelegenheiten, an
nationalen und internationalen Kongressen teilnehmen zu können ganz herzlich
bedanken. Herrn Prof. Dr. H. Jarry und Herrn Prof. Dr. W. Wuttke der Abteilung
Klinische und Experimentelle Endokrinologie der Universitätsmedizin Göttingen danke
ich ganz herzlich für die ausgezeichnete Zusammenarbeit im Rahmen des Projekts
„EURISKED“ sowie für die stete Unterstützung in fachlichen Angelegenheiten und die
nette Kommunikation rund um das Thema „Endokrin aktive Substanzen“. Herrn Prof.
Dr. J. Samarut und Dr. K. Gauthier, École normale supérieure in Lyon danke ich für die
Bereitstellung der TRα0/0-Mäuse. Weiterhin möchte ich mich bei Herrn Dr. M. Klein vom
„Centre Hospitalier et Universitaire“ in Nancy und Herrn Dr. R. Sapin vom „Hôpital Civil“
in Straßburg für die Durchführung der Serumanalysen bedanken. Herrn Dr. L.
Malendowicz vom „Department of Histology and Embryology“ der Universität Poznan
danke ich für die Durchführung der morphometrischen Analysen der Schilddrüsen.
Bei Frau PD Dr. F. Götz bedanke ich mich für ihre große Hilfe bei der Erstellung meines
ersten Tierversuchsantrags und ihre kompetente und freundliche Unterstützung bei der
anschließenden Durchführung. Bei Frau R. Großklaus, Frau K. Huhne und Frau J.
Merz bedanke ich mich für die große Unterstützung bei der Durchführung von
Histologien, qPCRs und Western blots. Für das stete Interesse an meiner Arbeit, die
konstruktiven Vorschläge und die kritische Durchsicht dieses Manuskripts bedanke ich
mich bei Herrn Prof. Dr. L. Schomburg und Herrn Dr. U. Schweizer auf das Herzlichste.
Für die Korrektur der Arbeit möchte ich mich herzlich bei Dipl.-Biol. T. Endermann und
Dipl.-Biol. E. Wirth bedanken. Mein besonderer Dank gilt außerdem allen Mitgliedern
dieser Arbeitsgruppe für die schöne Zeit im Labor, wobei ich namentlich Dr. P.
Hofmann, Dr. M. Michaelis, Dipl.-Ing. K. Renko, Dipl.-Ing. S. Roth, Dipl.-Biol. J. Chiu
und insbesondere Dipl.-Biol. E. Wirth hervorheben möchte. Meiner Familie und meinen
Freunden danke ich für ihre moralische Unterstützung aufs Herzlichste. Abschließend
möchte ich mich bei meinem Ehemann Michael Gotthardt für sein unendliches
Verständnis und seine stete Motivation bedanken…
VI
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
“ Zoll Ci Curie
Ø Durchmesser CoA Koaktivator (co-activator)
% Prozent CoR Korepressor (co-repressor)
°C Grad Celsius cpm counts per minute
129S2/Sv Inzuchtmausstamm CREBP cAMP response element binding protein
4-MBC 4-Methylbenzyliden-campher C threshold cycle
T
5SrRNA 5S-Untereinheit der ribosomalen RNA Cyp2a unspezifische Monooxigenase
5.8SrRNA 5.8S-Untereinheit der ribosomalen RNA Cyp2b unspezifische Monooxigenase
6H- 6 Hormon- Cyp3a unspezifische Monooxigenase
18SrRNA 18S-Untereinheit der ribosomalen RNA Cyp7 Cholesterin-7-Hydroxylase
28SrRNA 28S-Untereinheit der ribosomalen RNA Δ Änderung
αGSu/aGsu α-Glykoprotein-Untereinheit d Schichtdicke
(α-glycoprotein subunit)
α-MSH α-melanocyte stimulating hormone d Tag(e) (day)
αVβ3 Integrin Da Dalton
A Ampere DAB 3,3‘-Diaminobenzidin
Abb. Abbildung DAD deacetylase activating donor
AC Adenylatcyclase DBD DNA-Bindungsdomäne
ADI acceptable daily intake dCTP Desoxycytidintriphosphat
AF Aktivierungsfunktion ddNTP Didesoxyribonukleosid-triphosphat
AMP Adenosinmonophosphat DEPC Diethylpyrocarbonat
ANOVA Varianzanalyse (analysis of variance) DEHAL Dehalogenase
ApoA-1 Apolipoprotein A-1 DIO1/Dio1 Deiodase Typ 1
APS Ammoniumpersulfat DIO2/Dio2 Deiodase Typ 2
AR Androgenrezeptor DIO3 Deiodase Typ 3
ATP Adenosintriphosphat DIT Diiodtyrosin
bp Basenpaar(e) DMSO Dimethylsulfoxid
BP-2 Benzophenon-2 DNA Desoxyribonukleinsäure
(desoxyribonucleic acid)
BPA Bisphenol A dNTP Desoxynuclesidtriphosphat
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum DRIP vitamin D receptor interacting protein
albumin)
BTEB basic transcription element-binding dsDNA doppelsträngige DNA
protein (double stranded DNA)
Bu2cAMP Dibutyryl-cAMP DTT Dithiothreitol
b.w. Körpergewicht (body weight) DUOX/Duox Thyrooxidase
c Konzentration (concentration) ε molarer Extinktionskoeffizient
λ
C57BL/6 Inzuchtmausstamm E Effizienz
cAMP zyklisches AMP (cyclic AMP) E Extinktion bei einer Wellenlänge von x
λ
nm
CBP/p300 CREB binding protein E 17β-Estradiol-3-benzoat
2
CCR Center for Cardiovascular Research EB 17β-Estradiol-3-benzoat
2
cDNA komplementäre DNA EV 17β-Estradiol-valerat
2
(complementary DNA)
c-erbA cellular homolog of the avian EAC endokrin aktive Substanz
erythroblastosis virus, TRα2 (endocrine active compound)
ChIP Chromatin-Immunopräzipitation E. coli Escherichia coli
VII
Abkürzungsverzeichnis
ECL enhanced chemiluminescence Hepes 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-
ethansulfonsäure
ED Endokrine Disruptoren hnRNPA1 heterogenous nuclear ribonucleoprotein
A1
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure HPG Hypothalamus-Hypophysen-
Gonadenachse (hypothalamic-pituitary-
(ethylenediaminetetraacetic acid)
gonadal axis)
EMSA electrophoretic mobility shift assay HPT Hypothalamus-Hypophysen-
Schilddrüsenachse (hypothalamic-
pituitary-thyroid axis)
eNOS endothelial NO synthase Hprt Hypoxanthin-Phosphoribosyl-
Transferase
ENS École normale supérieure de Lyon HRP Meerrettich-Peroxidase (horseradish
peroxidase)
ER Östrogenrezeptor (estrogen receptor) hrTPO human recombinant TPO
EtBr Ethidiumbromid IC mittlere inhibitorische Konzentration
50
EtOH Ethanol IGF-1 insulin-like growth factor 1
EU Europäische Union IgG Immunglobulin G
EURISKED Multi-organic Risk Assessment of IHC Immunhistochemie
Selected Endocrine Disrupters
ExPASy Expert Protein Analysis System IL/Il Interleukin
f vorwärts (forward) INF Interferon
F1 Filialgeneration i.p. intraperitoneal
F12 Ham’s Nutrient Mixture F-12 IVC individually ventilated cages
F21388 synthetisches Falvonoid K Assoziationskonstante
a
FBS fötales Kälberserum kb Kilobase(n)
(fetal bovine serum)
FDA Food and Drug Administration Kdr kinase insert domain receptor
FGFR fibroblast growth factor receptor λ Wellenlänge
Flt1 FMS-related tyrosine kinase 1 LB Luria-Broth Medium
FRTL-5 Fischer rat thyroid low Serum LBD Liganden-Bindungsdomäne
FSH/Fshb Follikel-stimulierendes Hormon LDL low density lipoprotein
FT freies T LH/Lhb Luteinisierendes Hormon
3 3
FT freies T LPS Lipopolysacharid
4 4
g Gramm LSAB labeled (strept-)avidin-biotin
G G-Protein reguliertes Protein LT Levothyroxin
4
GATA2 GATA binding protein 2 M Molar
Gapdh Glycerinaldehyd-3-phosphat- MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase
Dehydrogenase
GC Guanin-Cytosin-Gehalt von Primern MCF-7 Brustkrebszellinie (MCF = Michigan
Cancer Foundation)
GEN Genistein MBH mediobasaler Hypothalamus
GH/Gh Wachstumshormon (growth hormone) MCT Monocarboxylattransporter
Glut-4 Glucosetransporter Typ 4 ME1/Me1 Malatenzym (malic enzyme 1)
GnRH Gonadotropin-releasing Hormon MGI Mouse Genome Informatics
GTC Guanidinisothiocyanat mGPD/mGpd2 mitochondriale Glycerol-3-phosphat-
Dehydrogenase
h Stunde(n) (hour) MHC/Myh myosin heavy chain
HO bidest. HO bidestillata min Minute(n) (minute)
2 2
hCG humanes Chorion Gonadotropin MIT Monoiodtyrosin
HDAC Histondeacetylase MMI Methimazol
HDL high density lipoprotein MMLV Moloney murine leukemia virus
HE Hämatoxylin-Eosin MOPS 3-(N-morpholino) Propansulfonsäure
VIII