Instrumentelle Analytik und Bioanalytik: Biosubstanzen, Trennmethoden, Strukturanalytik, Applikationen

566 Pages·2015·9.33 MB·German

by  Manfred H. Gey (auth.)

Springer-Lehrbuch
Manfred H. Gey
Instrumentelle Analytik
und Bioanalytik
Biosubstanzen, Trennmethoden,
Strukturanalytik, Applikationen
3. Auflage
Prof. Dr. rer. nat. habil. Manfred H. Gey
Hochschule Zittau/Görlitz
02763 Zittau
Deutschland
Büro: Mäuseburg-Center,
Marschnerstrasse 22, D-02763 Zittau,
www.papa-gey.de,
[email protected]
ISSN 0937-7433
Springer-Lehrbuch
ISBN 978-3-662-46254-6 ISBN 978-3-662-46255-3 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-662-46255-3
Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliogra(cid:191) e;
detaillierte bibliogra(cid:191) sche Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.de abrufbar.
Springer Spektrum
© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1998, 2008, 2015
Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht
ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung des Verlags.
Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Bearbeitungen, Übersetzungen, Mikrover(cid:191) lmungen und
die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen.
Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk be-
rechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der
Warenzeichen- und Markenschutz- Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann
benutzt werden dürften.
Der Verlag, die Autoren und die Herausgeber gehen davon aus, dass die Angaben und Informationen in
diesem Werk zum Zeitpunkt der Veröffentlichung vollständig und korrekt sind. Weder der Verlag noch
die Autoren oder die Herausgeber übernehmen, ausdrücklich oder implizit, Gewähr für den Inhalt des
Werkes, etwaige Fehler oder Äußerungen.
Gedruckt auf säurefreiem und chlorfrei gebleichtem Papier
Springer Berlin Heidelberg ist Teil der Fachverlagsgruppe Springer Science+Business Media
(www.springer.com)
In Liebe und als Dank
für Sigi, Anni, Tobi
und Orko

Freiheit ist ein Gut,
das durch Gebrauch wächst,
durch Nichtgebrauch dahinschwindet.
Carl Friedrich von Weizsäcker
Vorwort
Unter „Instrumenteller Bioanalytik“ versteht man ein umfassendes und vielseiti-
ges Arsenal analytischer Methoden zur Analyse und Charakterisierung niedermo-
lekularer Biosubstanzen und vor allem von Biopolymeren in komplexen biologi-
schen Matrices innerhalb der Biochemie und Pharmazie, Chemie und
Umweltchemie, Biologie und Genetik, Biomedizin und Immunologie, Biotechno-
logie und Toxikologie.
Das Buch soll Studenten, Diplomanden und Doktoranden dieser Fachrichtun-
gen sowie spezialisierten Laboranten und Technikern zur erfolgreichen Lösung
bioanalytischer Fragestellungen dienen.
Im Mittelpunkt des Buches stehen theoretische und methodische Grundlagen
über leistungsfähige Trennmethoden, Strukturanalytik und Kombinationen zwi-
schen beiden. Das instrumentelle Methodenspektrum reicht von der Hochleis-
tungsflüssigchromatographie (HPLC) und Biochromatographie (BioLC), der klas-
sischen Elektrophorese und Kapillarelektrophorese (CE) bis zur UV/VIS- und
Fluoreszenzspektroskopie, Massenspektrometrie (MS, MALDI-MS, MALDI-
PSD), Kernresonanzspektroskopie (NMR) und verschiedenen Kopplungsvarian-
ten der Chromatographie mit der Strukturanalytik (LC-MS).
Über jede einzelne dieser Methoden existieren ausführliche Monographien.
Zusammenfassende Darstellungen zur Funktionsweise und integrierten Anwen-
dung mehrerer bioanalytischer Methoden sind z.Z wenig bekannt. Das Buch soll
zur Schließung dieser Lücke beitragen.
In den vergangenen Jahrzehnten entwickelten sich hochqualifizierte Metho-
denspezialisten, die oft nur eine Technik (z.B. HPLC, Elektrophorese, GC, MS
oder NMR) perfekt beherrschten und ausübten. Heutzutage sind der integrierte
Einsatz und die Beherrschung mehrerer analytischer Methoden gefragt und unbe-
dingt notwendig.
HPLC und CE sind ein gutes Beispiel für den kombinierten und sich ergän-
zenden Methodeneinsatz. Mit Hilfe der HPLC können ca. 80% aller Substanzen
analysiert werden. Dies betrifft kleine Ionen oder Moleküle, polare und unpolare
Substanzen sowie hochmolekulare Biomoleküle wie Proteine oder Glycoproteine.
Die Kapillarelektrophorese wird als komplementäre Analysenmethode zur HPLC
angesehen. Was mit der HPLC nicht zu trennen ist, gelingt oft mit der CE oder
umgekehrt. Als Trennmethoden sind sie jedoch bei der Identifizierung unbekann-
ter biologischer Substanzen nur dann erfolgreich, wenn entsprechende Referenz-
substanzen zur Verfügung stehen.
V III Vorwort
Da dies nicht immer der Fall ist, sind neben präparativen Trenntechniken zu-
nehmend moderne Kopplungstechniken in Kombination mit strukturanalytischen
Methoden (LC-MS) erforderlich.
Ein besonderes Innovationspotential geht z.Z. von der Massenspektrometrie
mit schonenden Ionisierungstechniken aus. Insbesondere die neuen Electrospray-
und MALDI-Techniken sind in der Lage, sowohl niedere als auch hochmolekula-
re Biosubstanzen in ihren Strukturen bis fast in alle Einzelbausteine zu identifizie-
ren.
Das Buch beinhaltet weiterhin ausgewählte Applikationen u.a. aus den Berei-
chen Metallothioneine (Phytochelatine), Nucleobasen und Nucleoside, Kohlenhy-
drate, organische Säuren und Fettsäuren, die zu den kleineren Biosubstanzen ge-
hören.
Phospholipide und Neutrallipide, Nucleotide (DNA-Fragmente), Oligosaccha-
ride (Glycanketten von Glycoproteinen) und thermostabile Enzyme vertreten die
Biopolymere.
Es werden auch Methoden der Probenvorbereitung und -konzentrierung wie
Dialyse, Zentrifugation, Lyophilisation, Extraktion, Filtration, Fällung oder
Batch-Adsorption einbezogen.
Natürlich verfügen viele Universitäten, Hoch- und Fachschulen sowie kleinere
Institutionen und Firmen (noch) nicht über ein komplettes instrumentalanalyti-
sches Methodenspektrum (HPLC, CE, GC, MS, MALDI-MS, NMR, GC-MS, LC-
MS). Die Frage nach „ungeliebten“ zentralen analytischen Laboratorien könnte
deshalb im Vergleich zur etablierten dezentralen Analytik in den Forschungsinsti-
tutionen in Zukunft wieder verstärkt in den Vordergrund der Diskussion rücken.
Ziel dieses Buches ist es demzufolge auch, die Forscher und Anwender zu ver-
stärkten interdisziplinären Kooperationen auf analytischen Gebieten (Bioanalytik,
Umweltanalytik) zu motivieren. Die anschaulich und verständlich hier dargestellte
Methodenvielfalt soll einen Ansatzpunkte dafür bieten.
Für ein vertieftes Studium von einzelnen (bio)analytischen Methoden ist es
ratsam, die angegebene weiterführende Spezialliteratur hinzuzuziehen. Dies be-
trifft insbesondere die Kenntnisse auf dem Gebiet der NMR und MS sowie über
Struktur und Funktion von Biomolekülen, die in den einführenden Abschnitten
nur kurz behandelt werden.
Das Buch resultiert aus meiner Forschungs- und Lehrtätigkeit auf dem Gebiet
der Bioanalytik, die ich in den vergangenen Jahren im Institut für Biotechnologie
Leipzig der Akademie der Wissenschaften der ehemaligen DDR (1986-1991),
dem Institut für Anorganische und Analytische Chemie der Johannes-Gutenberg-
Universität Mainz (1991-1995) und dem Institut für Biochemie der Martin-
Luther-Universität Halle-Wittenberg (1996-1997) durchgeführt habe.
Meine Überzeugung ist, daß in Zukunft die Bioanalytik in Forschung und Leh-
re einen höheren Stellenwert erhält und ein neues innovatives „Wissenschafts-
gebiet“ darstellen wird.
Vorwort IX
Fast alle Graphiken und Abbildungen sowie der gesamte Text wurden von mir
selbst erstellt und in den Computer „hinein getippt“. Für die Chromatogramme
und Spektren erfolgte zur anschaulicheren Präsentation eine zusätzliche Bearbei-
tung.
Nach anfänglicher Frustration habe ich die Bearbeitung des Buches mit dem
Computer und entsprechenden Programmen schätzen gelernt und kann mir heute
die analytische Forschungs- und Lehrtätigkeit ohne diese „Werkzeuge“ nicht
mehr vorstellen. Es sind 26 MB Datenmaterial zusammengekommen, die jederzeit
ergänzt und erweitert werden können. Auf Grund der Vielfalt der Methoden und
Spezialgebiete werden Verbesserungen ständig notwendig sein. Für entsprechen-
de Anregungen und Hinweise wäre ich sehr dankbar.
Weiterhin möchte ich vielen Fachkollegen/-innen, die meinen Weg als „Bio-
Analytiker“ begleitet und gefördert haben, einen herzlichen Dank für die zahlrei-
chen positiven Diskussionen, Hilfen und Ratschläge aussprechen.
Mein besonderer Dank gilt der Lektorin Frau Dr. Angelika Schulz vom Vie-
weg-Verlag für Ihr Engagement und Ihre Geduld während der Erstellung des Bu-
ches.

Leipzig am 3. Juni 1998 Manfred H. Gey
Vorwort zur 2. Auflage
Der aktualisierte Titel „Instrumentelle Analytik und Bioanalytik“ reflektiert die
deutlich erweiterten Inhalte des neuen Buches und ein noch umfangreicheres Me-
thodenspektrum. Das betrifft die analytischen Trenntechniken HPLC, TLC und
GC sowie spektroskopische Methoden wie die Infrarotspektroskopie (IR) und die
Atomspektroskopie (AAS, OES, ICP-MS). Auch das Arsenal der Präanalytik
(SPME, SPE u.a.) ist aktualisiert und ausführlicher dargestellt.
Innerhalb der Kopplung von instrumentellen Methoden untereinander (LC-
NMR, GC-FTIR) oder von bioanalytischen Techniken (2-D-Elektrophorese) sind
rasante Entwicklungen und neue Innovationen zu verzeichnen. Die Kopplungs-
techniken („hyphenated techniques“) beinhalten auch Kombinationen zwischen
Methoden der Probenvorbereitung und der Chromatographie (SPE-LC, SPME-
GC) sowie von Säulenschalttechniken wie LC-LC oder GC-GC. Die unterschied-
lichsten Kopplungen und die Kombinationen innerhalb der LC-MS (LC-ESI-MS,
LC-APCI-MS, LC-APPI-MS) werden ausführlich und anhand von Applikations-
beispielen vorgestellt.
Neu innerhalb der Bioanalytik ist auch das hoch innovative Forschungsgebiet
der Proteomanalytik (Proteomics), für das eine erste Einführung präsentiert wird.
Die Grundlagen und Applikationen bereits bekannter Immunoassays und von Bio-
sensoren tragen außerdem zur Erweiterung der Bioanalytik bei.
Für eine möglichst schnelle und verständliche Erklärung (bio)analytischer Me-
thoden sowie für die Darstellung repräsentativer Applikationen wurden zahlreiche
neue Zeichnungen bzw. Abbildungen erstellt. Sie sollen den Einstieg von Studen-
ten und Mitarbeitern in die Instrumentelle Analytik und Bioanalytik fördern.
Zielgruppen sind neben den Studenten auch wissenschaftliche und technische
Mitarbeiter sowie Doktoranden vor allem innerhalb neuer innovativer Gebiete der
Biowissenschaften (Bioanalytik/Biochemie, Biotechnologie, Biomedizin, Phar-
mazie, Lebensmittelchemie, Toxikologie, Alternativ-Energien) aber auch klassi-
scher Gebiete wie Umweltchemie/Technische Chemie oder Chemie und Energie.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Peter Enders, Dr. Steffen Pauly und Frau
Pamela Frank vom Springer-Verlag für die stetige Motivation, Geduld und das
Engagement innerhalb der Realisierung dieser 2. Auflage.

Zittau am 29. Februar 2008 Manfred H. Gey
Vorwort zur 3. Auflage
Die 3. Auflage des Buches „Instrumentelle Analytik und Bioanalytik“ verbindet
die bewährten Kapitel der 2. Auflage vor allem mit neuen Applikationen und neu-
en methodischen Entwicklungen auf dem Gebiet der Hochleistungs-Chromato-
graphie – meist in Kombination mit der Massenspektrometrie (MS).
Die Ultra fast HPLC (UHPLC) erobert zunehmend die analytischen Laborato-
rien, wo es auf Schnelligkeit und Kostenoptimierung ankommt. Trennungen in
wenigen Minuten oder sogar im Sekundenbereich werden erzielt – oft verbunden
mit sehr hohen Drücken bis 1000 bar, die beim Arbeiten mit kleinen Partikeln der
stationären Phase < 2 µm die Folge sind.
Schnelle Substanz-Separationen gelingen auch mit CoreShell-Materialien oder
Monolithischen Trennsäulen. Für polare Substanzen ist HILIC prädestiniert. Dazu
gehören Pharmaka, die mit diesen Säulen in Kombination mit MS/MS sehr effi-
zient und mit hoher Sensitivität in komplexen, umweltrelevanten und biologischen
Matrices bestimmbar sind.
Die neuen Applikationen beziehen sich auch auf die Pharmaka-Analytik, wo-
bei hier bewährte und sich ergänzende Methoden (Reversed-Phase-, Ionenpaar-
HPLC, Kapillarelektrophorese, CE) im Fokus stehen.
Innerhalb der Drogenanalytik ist die Nachweisbarkeit im Blut und im Urin
zeitlich limitiert. Metaboliten können oft länger erfasst werden. Das betrifft auch
den Nachweis von nur geringen Mengen an Cocain und seinen Metaboliten mit-
tels GC-MS in Haaren. Die Spurenanalytik kann vor allem am Beispiel der Dioxi-
ne transparent gemacht werden. Dioxingehalte im pg- oder auch fg-Bereich erfor-
dern effektive und reproduzierbare Probenkonzentrierungen, hochauflösende GC-
MS-Kopplungen sowie spezielle Labore und sehr gut qualifiziertes Personal. Ne-
ben der Analytik sind vor allem auch repräsentative Toxizitätsbetrachtungen zu
den einzelnen Dioxin-Kongeneren von enormer Wichtigkeit.
Neu ist auch ein Überblick zur Aminosäureanalytik, bei der flüssigchromato-
graphische Methoden an Ionenaustauschern mit Nachsäulen-Derivatisierung (post
column detection) und Derivatisierungen vor der Trennsäule (pre column detec-
tion) im Fokus stehen.
Ein weiteres Kapitel zur Zuckeranalytik wurde einbezogen, das sich auch in-
haltlich mit der Problematik der Lactose-Intoleranz beschäftigt.

Leipzig am 9. November 2014 Manfred H. Gey