implementación de técnicas de secuenciación masiva para el desarrollo de nuevos algoritmos ...

110 Pages·2017·3.02 MB·Spanish

TESIS DOCTORAL

IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN
MASIVA PARA EL DESARROLLO DE NUEVOS ALGORITMOS
DIAGNÓSTICOS Y BIOINFORMÁTICOS EN DISTROFIAS
HEREDITARIAS DE RETINA

DOCTORANDA: NEREIDA INÉS BRAVO GIL
DIRECTOR: GUILLERMO ANTIÑOLO GIL
DEPARTAMENTO: CIRUGÍA, UNIVERSIDAD DE SEVILLA
PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGÍA MOLECULAR, BIOMEDICINA E
INVESTIGACIÓN CLÍNICA

ÍNDICE

ÍNDICE DE CONTENIDO 
1.  INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1 

1.1 La visión............................................................................................................................................... 3

1.1.1 El globo ocular .............................................................................................................................. 3

1.1.2 La retina .......................................................................................................................................... 4

1.1.3 Fisiología visual ........................................................................................................................... 6

1.1.3.1 Los fotorreceptores ........................................................................................................... 6

1.1.3.2 Fototransducción y ciclo visual .................................................................................... 9

1.2 Distrofias hereditarias de retina ............................................................................................ 13

1.2.1 Clasificación................................................................................................................................ 13

1.2.1.1 Formas periféricas .......................................................................................................... 14

1.2.1.2 Formas centrales ............................................................................................................. 17

1.2.1.3 Formas mixtas .................................................................................................................. 20

1.2.1.4 Formas sindrómicas ....................................................................................................... 22

1.2.2 Heterogeneidad clínica y genética .................................................................................... 24

1.2.3 Genes asociados a DHR.......................................................................................................... 26

1.2.4 Aproximaciones para la identificación de nuevos genes candidatos ................ 28

1.2.5 Terapias y tratamientos ........................................................................................................ 31

1.3 Secuenciación de Nueva Generación ................................................................................... 34

1.3.1 Principales plataformas basadas en la NGS .................................................................. 34

1.3.2 Aplicaciones de la NGS ........................................................................................................... 37
2.  HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .......................................................................................... 43 
1.3.3 Desarrollo de nuevas tecnologías: Secuenciación de lecturas largas ................ 40

2.1 Hipótesis ........................................................................................................................................... 45
3.  ESTUDIOS REALIZADOS ........................................................................................... 47 
2.2 Objetivos .......................................................................................................................................... 46
  RP1 BBS1

3.1 Artículo I: Nuevas mutaciones en y una variante recurrente en

explican la coexistencia de dos distrofias de retina distintas en la misma familia. ................... 49
USH2A  
3.2 Artículo II: La re‐evaluación de una familia pone en duda la patogenicidad de la

mutación p.Cys759Phe de en homocigosis. ................................................................................. 65

3.3 Artículo III: Mejora en el manejo de las distrofias hereditarias de retina

mediante la secuenciación dirigida de un panel de genes específico de población. .................. 77

3.4 Artículo IV: Desentrañando las bases genéticas de los casos aislados de
  SYNE2
retinosis pigmentaria: un estudio a gran escala. ....................................................................................... 93

3.5 Artículo V: Identificación de como un nuevo gen candidato asociado a
4.  RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................. 139 
retinosis pigmentaria autosómica recesiva. ............................................................................................. 117
5.  CONCLUSIONES ........................................................................................................ 151 
6.  BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 155 
7.  ANEXOS ....................................................................................................................... 173 

7.1 ANEXO I ......................................................................................................................................... 175

7.2 ANEXO II ........................................................................................................................................ 183
  7.3 ANEXO III ...................................................................................................................................... 187

ABREVIATURAS

ABREVIATURAS

Actin-binding domains
ABDs , dominios de unión a actina
ACHM Acromatopsia
ACL Amaurosis congénita de Leber
AD Autosómico dominante
ADN Ácido Desoxirribonucleico
ADNc ADN codificante
Arrayed primer extension
AFG Angiografía fluoresceínica
APEX
AR Autosómico recesivo
ARN Ácido ribonucleico
ARNm Ácido ribonucleico mensajero
AVC Alteraciones en la visión de los colores
A2E N-retinildeno-N-retinil-etanolamina
Burrows-Wheeler Aligner
A2PE N-retinilideno-N-retinil-fosfatidiletanolamina
BWA
chromatin immunoprecipitation sequencing
Cas9 Caspasa 9
ChIP-seq
CHM Coroideremia
Copy number variations,
CNCE Ceguera nocturna congénita estacionaria
Cone photoreceptor function loss 8
CNVs Variaciones en el número de copias
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
cpfl8
,
CRISPR Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente
Ciberer Spanish Variant Server
interespaciadas
CSVS
DC Distrofia de conos
DCB Distrofia de conos y bastones
DHR Distrofias hereditaria de retina
DM Distrofia macular
DME Distrofia macular asociada a la edad (DME)
dNTP Desoxinucleótidos trifosfato
EPR Epitelio pigmentario de la retina
Exome Variant Server
ERG Electrorretinograma
Exome Aggregation Consortium
EVS
Genome Analysis Toolkit
ExAC
GATK
Tesis doctoral Nereida Bravo Gil

GCAP Proteínas activadoras de la guanilato ciclasa
GMPc Guanosín monofosfato cíclico
Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton
KASH Klarsicht, ANC1, Syne/NesprinHomology
LINC
Minor Alelle Frequency,
LX Ligado al cromosoma X
Mendelian Inheritance in Man
MAF frecuencia del alelo menor
MIM
Multiplex-ligation probe amplification
miRNAs Micro ARN
Nesprin2 Nuclear envelope spectrin repeat protein 2
MLPA
Next-generation sequencing
Oxford Nanopore Technologies
NGS , Secuenciación de nueva generación
Open reading frame 15
ONT
Pacific Biosciences
ORF15 , Marco abierto de lectura 15
PacBio
Polymerase Chain Reaction
pb Par de bases
Retinal degeneration 10
PCR , Reacción en cadena de la polimerasa
RNA sequencing
rd10
RNA-seq , Secuenicación de ARN
RP Retinosis Pigmentaria
RPe Retinosis Pigmentaria esporádica
RS Retinosquisis
Short hairpin RNA
SBB Síndrome de Bardet Biedl
Single Molecule Real Time
shRNAs
, Secuenciación a tiempo real de una única
SMRT Single Nucleotide Variants
molécula de ADN
SNVs , Variantes de un solo nucleótido
Syne2 Synaptic nuclear envelope protein 2
STGD Enfermedad de Stargardt
University of California, Santa Cruz
UCSC
Whole exome sequencing
USH Síndrome de Usher
Whole genome sequencing
WES , Secuenciación del exoma completo
WGS , Secuenciación del genoma completo