fragmentación de adn espermático en pacientes infértiles y su correlación con técnicas de ...

142 Pages·2013·5.86 MB·Spanish

Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas.
Carrera de Doctorado en Ciencias de la Salud.

FRAGMENTACIÓN DE ADN ESPERMÁTICO EN
PACIENTES INFÉRTILES Y SU CORRELACIÓN CON
TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA DE ALTA
COMPLEJIDAD (ICSI)

Tesis de Doctorado en Ciencias de la Salud
Bioquímico Conrado Avendaño

2013
Instituto y Cátedra de Fisiología Humana
Facultad de Ciencias Médicas
Universidad Nacional de Córdoba
RD 2053/09
Director de Tesis:
Prof. Dr. Rubén Daniel Ruiz
Instituto y Cátedra de Fisiología Humana
Facultad de Ciencias Médicas
Universidad Nacional de Córdoba

Co-Director:
Prof. Dr. Sergio Oehninger
Jones Institute for Reproductive Medicine
Director of the Division of Reproductive Endocrinology
and Infertility
Professor and Vice Chair of the Department of
Obstetrics and Gynecology
Professor of Urology
Eastern Virginia Medical School
Norfolk, Virginia, USA
Comisión de seguimiento:

Prof. Dra. Susana Rubiales de Barioglio

Prof. Dr. Otilio Rosato

Tribunal de Tesis

Prof. Dr Otilio Rosato

Prof. Dr. Carlos Lopez

Prof. Dr. Héctor Gauna
Agradecimientos

Las tesis doctorales son consideradas la culminación de la formación en cada
profesional y es vista como un logro absolutamente personal. Sin embargo creo que sin
el apoyo de un sin número de personas esta tesis no podría haber tomado forma y sido
terminada. En cada párrafo de esta tesis hay cosas que fui aprendiendo de diferentes
personas que me fueron formando y que hicieron que al final del camino pudiera armar
este manuscrito. Mi más entero agradecimiento a todos ellos que sin saberlo han
contribuido a mi formación y esto también es un logro de ellos, por “bancarme”.
Quisiera agradecer profundamente a mi Director de Tesis el Profesor Doctor Rubén
Ruiz quien me abrió las puertas de la cátedra de Fisiología Humana de la Facultad de
Ciencias Médicas y brindó todo su apoyo para poder realizar este trabajo. También a mi
Co-Director el Profesor Doctor Sergio Oehninger quien me apoyó y me permitió “volar”
para poder realizar gran parte de esta tesis. A la comisión de seguimiento Profesora
Doctora Susana Rubiales y el Profesor Doctor Otilio Rosato quienes me orientaron en el
armado del manuscrito.
Por otro lado quisiera agradecer a todas las personas e instituciones que de alguna u
otra manera me ayudaron e incentivaron a realizar este trabajo de tesis doctoral. Al
Jones Institute for Reproductive Medicine, de Norfolk, Virgina, USA que me cobijó en
los primeros años de esta tesis (aun cuando todavía no estaba en mis planes realizar una
tesis doctoral). Principalmente al laboratorio de Andrología y al de Embriologia “del
Jones” quienes me enseñaron “sin querer” mucho más que algunas técnicas. También al
Instituto de Fisiología Humana de la Facultad de Ciencias Médicas de la UNC que me
abrió sus puestas y me permitió poder poner a punto la técnica de TUNEL en animales.
Especialmente a Santiago Bianconi y Graciela Stutz quienes accedieron a que me acople
a sus trabajos para poder utilizar la técnica.
A cada uno de los integrantes de Nascentis quienes me “cobijaron” a mi regreso de
Argentina, principalmente a César Sánchez Sarmiento quien creyó en mi y me abrió las
puertas de la institución para que el retorno no haya sido tan difícil. A Ariela, Silvina,
Andrés, Gustavo y uff TODOS… sin palabras para agradecerles todo el apoyo y la
buena onda.
A cada uno de mi familia que me ha apoyado en todo momento, especialmente a “mi
mamá que me parió”. A Anahí Franchi quien me apoyó para poder concretar este
trabajo. A mi hija Lucia que me “permitió” en sus ratos de tranquilidad y sueño poder
escribir esta tesis.
A mis amigos de la profesión que fui cosechando en este camino: José Horcajadas
(quien es un ejemplo a seguir), Rosa Molina (que fue la que me impulsó a realizar esta
tesis y me recomendó la catedra de fisiología), Gustavo Doncel (un ídolo que me
permitió ser su amigo).
A mis amigos de la vida (no son tantos pero sería imposible mencionarlos a todos así
que todo aquel amigo que lea esto…. siéntase incluido!!!) que me han soportado y
espero lo sigan haciendo.
Gracias a todos!!!!!
A mi familia
"LA FACULTAD DE CIENCIAS MEDICAS NO SE HACE SOLIDARIA CON LAS
OPINIONES DE ESTA TESIS”
(Art. 43.- Reglamento de la Carrera de Doctorado en Ciencias de la Salud - RHCD
722/2010 y 210/2011; RHCS 1027/2010 y RHCS 327/2011)
ÍNDICE

Resumen 1
Abstract 2
INTRODUCCIÓN 3
La gameta femenina: el ovocito 5
La gameta masculina: el espermatozoide 6
La fertilización 9
Técnicas de Reproducción Asistida 12
Fallas en la embriogénesis consecuencia de anomalías en la cromatina
espermática 14

Fragmentación del ADN espermático 14
Fragmentación del ADN durante el proceso de espermiogénesis 17
Daño post-testicular del ADN 17
Métodos para la evaluación de la fragmentación del ADN 18
Impacto de la fragmentación de ADN espermático en la fertilización
y el embarazo 21
Aplicación de la técnica de TUNEL en espermatozoides de ratón 22

OJETIVOS 23

MATERIALES Y MÉTODOS 24
Diseño experimental 25
Recolección y preparación de las muestras de semen 26
Análisis de semen 27
Estimulación ovárica 28
ICSI y ensayo de calidad embrionaria 28
Evaluación de fragmentación de ADN en espermatozoides humanos 30
Evaluación simultánea de la fragmentación de ADN y morfología
espermática 31

Evaluación de fragmentación de ADN en espermatozoides de ratón 32
Evaluación de fragmentación de ADN en espermatozoides de ratón
tratados con dieta enriquecida con ácidos grasos omega 3 32

Análisis estadístico 32

RESULTADOS 34
Estudio de la fragmentación de ADN y su impacto en ICSI 35
Caracteristicas seminales de las muestras evaluadas 35
Evaluación de fragmentación de ADN en pacientes de ICSI 35
Parámetros seminales y fragmentación de ADN 38
Estudio de la fragmentación de ADN en subpoblaciones de
espermatozoides con diferentes morfologías 38
Fragmentación de ADN en espermatozoides morfológicamente normales 41
Fragmentación de ADN en espermatozoides morfológicamente
normales y su impacto en ICSI 47
Determinantes de la calidad embrionaria 50
Predictores de embarazo 52
Puesta a punto y validación de la técnica de TUNEL en espermatozoides de
ratón 56

Impacto en la integridad del ADN en espermatozoides de ratón
alimentados con dieta enriquecida en ácidos grasos 3 57

DISCUSIÓN 58

CONCLUSIONES 72

BIBLIOGRAFÍA 74

ANEXO I 87
Notas de autorización para utilización de resultados 88

ANEXO II 90
Trabajos publicados 91

ANEXO III 131
Trabajos presentados en congresos 132