Foto-Bibliothek für lebensmittelassoziierte aerobe Sporenbildner

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Foto-Bibliothek für lebensmittelassoziierte
aerobe Sporenbildner
Version 10/2010

Diese Datei „Foto-Bibliothek für lebensmittelassoziierte aerobe Sporenbildner“ mit Fotos von Zell- und
Koloniemorphologie aerober Endosporenbildner dient als Ergänzung zur Identifizierung dieses Bakteri-
entaxon mit Fourier-Transform Infrarot-Spektroskopie (FTIR). Bebildert sind alle Arten, von denen FTIR-
Spektren in den Spektren-Bibliotheken für aerobe Sporenbildner abgelegt sind. In der vorliegenden
Fotogalerie werden zudem in knapp gefassten Steckbriefen die wichtigsten Merkmale zur Morphologie,
Physiologie und Systematik der diversen Arten aufgezeigt. Bei den Beschreibungen wurden insbeson-
dere lebensmittelrelevante Aspekte berücksichtigt. Die Spektren-Bibliothek und die Foto-Galerie umfas-
sen die Taxa Alicyclobacillaceae, Bacillaceae, Paenibacillaceae, Planococcaceae und Sporolactobacil-
laceae (siehe auch Homepage der Abteilung Mikrobiologie am ZIEL).

Text und Fotos:
Dr. Herbert Seiler
Zentralinstitut für Ernährungs- und Lebensmittelforschung (ZIEL)
Abteilung Mikrobiologie
Technische Universität München
Weihenstephaner Berg 3
D-85354 Freising, Germany
phone: [phone] / 71-2257 (Büro)
phone: [phone] / 71-5098 (Labor)
phone: [phone] / 1390 (Privat)
fax: [phone] / 71-4492 (Büro)
[email protected] (Büro)
[email protected] (Privat)
http://www.WZW.TUM.de/micbio
Fotogalerie für aerobe Bazillen Seite 2

Liste der beschriebenen Species (133)
[ zur Beschreibung bitte anklicken]
Alicyclobacillus acidocaldaricus
Alicyclobacillus acidoterrestris
Alicyclobacillus cycloheptanicus
Aneurinibacillus migulanus
Aneurinibacillus thermoaerophilus
Anoxybacillus contaminans
Anoxybacillus flavithermus
Anoxybacillus rupiensis
„Bacillus aminovorans"
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus aquimaris
Bacillus arsenicus
Bacillus atrophaeus
Bacillus badius
Bacillus bataviensis
Bacillus benzoevorans
„Bacillus caldolyticus"
„Bacillus caldotenax"
„Bacillus caldovelox"
Bacillus cereus
Bacillus circulans
Bacillus clarkii
Bacillus clausii
Bacillus coagulans
Bacillus cohnii
Bacillus drentensis
Bacillus firmus
Bacillus flexus
Bacillus foraminis
„Bacillus gallaeciensis“
Bacillus gelatini
Bacillus gibsonii
Bacillus ginsengihumi
“Bacillus gottheilii“
„Bacillus granadensis“
Bacillus horikoshii
Bacillus horneckiae
Bacillus idriensis
Bacillus infantis
Bacillus insolitus
“Bacillus kochii“
Bacillus lentus
Bacillus licheniformis
Bacillus litoralis
„Bacillus macroides“
Bacillus massiliensis
Bacillus megaterium
Bacillus mojavensis
Bacillus mycoides
Bacillus niabensis
Bacillus niacini
Bacillus oleronius
Fotogalerie für aerobe Bazillen Seite 3

Bacillus patagoniensis
„Bacillus pichinotyi“
Bacillus pocheonensis
Bacillus polyfermentans
Bacillus pseudofirmus
Bacillus pseudomycoides
Bacillus psychrodurans
Bacillus psychrosaccharolyticus
Bacillus pumilus
Bacillus shackletonii
Bacillus simplex
Bacillus siralis
Bacillus smithii
Bacillus sonorensis
Bacillus sporothermodurans
Bacillus subtilis
Baillus thermcoamylovorans
Bacillus thuringiensis
Bacillus vallismortis
Bacillus vedderi
Bacillus velezensis
Bacillus weihenstephanensis
Brevibacillus agri
Brevibacillus borstelensis
Brevibacillus brevis
Brevibacillus centrosporus
Brevibacillus formosus
Brevibacillus ginsengisoli
Brevibacillus laterosporus
Brevibacillus parabrevis
Exiguobacterium acetylicum
Exiguobacterium aurantiacum
„Exiguobacterium panipatensis“
Geobacillus caldoxylosilyticus
Geobacillus kaustophilus
Geobacillus stearothermophilus
Geobacillus thermocatenulatus
Geobacillus thermodenitrificans
Geobacillus thermoleovorans
Gracilibacillus sp.
Lysinibacillus fusiformis
Lysinibacillus sphaericus
Ornithinibacillus bavariensis
Ornithinibacillus californiensis
Paenibacillus alginolyticus
Paenibacillus alvei
Paenibacillus amylolyticus
Paenibacillus assamensis
Paenibacillus barcinonensis
Paenibacillus borealis
Paenibacillus chitinolyticus
Paenibacillus cookii
„Paenibacillus ginsengagri“
Paenibacillus glucanolyticus
Fotogalerie für aerobe Bazillen Seite 4

Paenibacillus graminis
Paenibacillus humicus
Paenibacillus illinoisensis
Paenibacillus lactis
Paenibacillus larvae
Paenibacillus lautus
Paenibacillus macerans
Paenibacillus macquariensis
Paenibacillus motobuensis
Paenibacillus odorifer
Paenibacillus pabuli
Paenibacillus pasadenensis
Paenibacillus polymyxa
Paenibacillus provencensis
Paenibacillus stellifer
Paenibacillus thiaminolyticus
Paenibacillus turicensis
Solibacillus silvestris
Sporolactobacillus laevolacticus
Sporosarcina aquimarina
„Sporosarcina ginsengisoli“
Sporosarcina globispora
Sporosarcina pasteurii
Sporosarcina psychrophila
Sporosarcina ureae
Terribacillus goriensis
Virgibacillus pantothenticus
Fotogalerie für aerobe Bazillen Seite 5

Vorwort
Diese Datei soll die Identifizierung von Bazillen mit FTIR unterstützen. Erhält man beispielsweise in der
Hitliste nicht so ganz eindeutig als ersten Hit die Species Bacillus megaterium, so ist es vorteilhaft, die
Richtigkeit der Angabe anhand der Zell- und Koloniemorphologie zu verifizieren. Die Fotos in der ent-
sprechenden Beschreibung geben einen Eindruck von den typischen Morphologien. Bei Bacillus mega-
terium ist die Zellform der Riesenzellen mit den Reservestoffeinschlüssen ausgesprochen charakteris-
tisch; die Kolonien sind meist cremeweiß und schleimig. Die Ausprägung der Sporulation und auch die
Kolonieform sind von dem Nährmedium und anderen Kultivierungsbedingungen abhängig. Aus diesem
Grund werden hier meist Fotos von einem mageren Nährmedium und einem reichen Medium gezeigt.
PCMA und TSGA stehen häufig stellvertretend für diese beiden Varianten. Auf einem reichen Medium
sporulieren einige Sporenbildner sehr schlecht oder im Einzelfall gar nicht. Andererseits sind die Kolo-
nien auf dem mageren Medium recht eintönig und damit wenig charakteristisch. Manche Bazillen bilden
glasige oder pigmentierte Kolonien. Wichtige Merkmale sind auch Form und Lage der Sporen und Ges-
talt der Sporangien. Auf ähnliche oder verwandte Formen wird ein Hinweis gegeben. Bei Bacillus mega-
terium, um bei diesem Beispiel zu bleiben, wird auf die Art Bacillus flexus verwiesen, die ähnlich große
Zellen bildet. Thermophile Arten wachsen nicht oder nur schwach bei z. B. 30 °C; hier wird häufig ein
Vergleich der Kolonien bei etwa 30 °C und bei z. B. 55 °C gezeigt oder ganz auf die Abbildung bei nied-
riger Bebrütungstemperatur verzichtet. Manche Arten wachsen schlecht auf PCMA oder TSGA; dies
war der Anlass, auch andere Medien zu beimpfen und davon Fotos in die Datenbank mit aufzunehmen.
Manche Arten versporten so schlecht, dass es nicht gelang, wirklich gute Fotos von versporten Zellen
zu erhalten. Aber auch dies ist dann ein Charakteristikum einer Species, wenngleich es vorkommen
kann, dass nur der verwendete Stamm, beispielsweise ein durch viele Jahre Laborkultur degenerierter
Typstamm, schlecht versport und frisch aus der Natur isolierte Wildstämme diesen Mangel nicht aufwei-
sen würden. Der einzige uns vorliegende Stamm der Species Bacillus aquimaris zeigte keine Sporulati-
on, obwohl wir diese mit allen möglichen Mitteln (Kochsalz, Mangansalz, 20 verschiedene Medien,
Temperaturstress, UV-Stress, Trockenstress etc.) zu provozieren versuchten.

Man sollte sich immer bewusst sein, dass die Morphologie keine absolute Konstante ist, sondern jede
Art ein mehr oder weniger breites Spektrum von Erscheinungsbildern aufweist. Dies kann man bei-
spielsweise bei Bacillus subtilis sehen, wo eine ganze Reihe von unterschiedlichen Kolonieformen ab-
gebildet ist. Es sei auch darauf hingewiesen, dass das Alter der Kolonien zu berücksichtigen ist. Der
von Bacillus subtilis-Kolonien ausgeschiedene Schleim trocknet relativ schnell ein, so dass auf einer
Agarplatte einerseits dicht liegende Kolonien, die Ihr Wachstum aufgrund der Konkurrenzsituation be-
reits eingestellt haben und andererseits einzeln liegende Kolonien, die noch aktiv wachsen, sehr unter-
schiedlich aussehen können - nämlich krustig-rau bzw. schleimig-glänzend. Ebenso wird Größe und
Form der Zellen sowie Geschwindigkeit und Umfang der Sporulation von vielen Parametern der Kultivie-
rung (Sauerstoff, Temperatur, Nährstoffe, Licht, Wasser) und der aktuellen Vitalität eines Stamms (1., 2.
oder 3. Subkultur in kurzer Folge) beeinflusst.

Natürlich gibt es auch etliche Arten, die sich morphologisch nicht oder kaum unterscheiden. Dies ist
insbesondere bei den Paenibazillen der Fall. Hier könnte man sogar in die Irre geführt werden, wenn
man der Koloniemorphologie eine zu große Bedeutung einräumen würde. Diese Arten zeigen gelegent-
lich ein starkes Schwärmverhalten. Agarplatten werden manchmal so stark und homogen von einem
glasigen Film überzogen, dass man bei flüchtiger Betrachtung meinen könnte, hier läge gar kein
Wachstum vor. Das Schwärmen ist ein mutatives Verhalten; dieselbe Kultur kann bei mehreren Animp-
fungen auf dem gleichen Agarmedium einmal schwärmen und das andere Mal nicht. Manchmal wächst
aus einer glattrandigen Kolonie unvermittelt ein Dendritenarm-ähnliches Schwärm-„Bäumchen“ auf die
unbewachsene Agarfläche. Dies wird im Folgenden anhand von Agarplattenfotos dokumentiert. Bleibt
zu erwähnen, dass auch mit FTIR-Spektroskopie die Identifzierung der Paenibazillen auf Artebene nicht
sehr zuverlässig ist. Offenbar wurde hier bereits auf dem Speciesniveau zu fein aufgesplittet.

Zum Glück kann man heute mit Sequenzierung der 16S-rDNA, anderer chromosomaler DNA oder
Plasmid-DNA die Identität eines Isolats ziemlich klar bestimmen. Irritationen bezüglich der Artzugehö-
rigkeit gehören damit weitgehend der Vergangenheit an. Im Zweifel bei einer Stammbenennung wurden
von uns die molekularbiologischen Methoden angewandt. Leider gibt es aber immer noch einige Mängel
bei der Systematik der Sporenbildner. Zum einen findet man offensichtliche Falscheinträge in der von
uns zu Rate gezogenen BLAST-Referenzdatei. Diese Einträge scheint niemand zu kontrollieren. Auch
alte, nicht mehr gültige, synonyme Artnamen werden dort nicht korrigiert. Und andererseits gibt es wohl
Kollegen, die munter neue Arten definieren und nicht prüfen, ob es nicht schon benannte Arten mit z. B.
> 98% Sequenzhomologie bei der 16S-rDNA gibt. In der BLAST-Liste wechseln sich dann wiederholt
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zwei oder gar mehrere Arten in der Reihung ab. Unterscheiden sich zwei Formen etwa nur in der auffäl-
ligen Reaktion „Verwertung von Nicotin“ oder der Ausprägung eines Pigments, so würde das höchstens
eine Subspecies begründen, aber nicht gleich eine neue Art. Wir empfehlen, bei dem Vergleich mit
BLAST, EzTaxon, ARB oder ähnlichen Programmen die Möglichkeit der Begrenzung auf Typstämme zu
nutzen oder wenigstens die Sequenzen der „uncultured strains“ auszuschließen.

Natürlicherweise muss die Foto-Bibliothek unvollständig bleiben. Wir haben uns auf die wichtigsten
lebensmittelrelevanten aeroben bis fakultativ anaeroben Endosporenbildner beschränkt. Zusätzlich
wurden einige Arten integriert, die aus einem Projekt über die Keimflora des Umfeldes einer Pharma-
produktion stammten (Luft und Oberflächen von Reinräumen). Von allen hier wiedergegebenen Species
und Subspecies liegen FTIR-Spektren vor. Welch nahezu monströse Aufgabe es wäre, alle beschriebe-
nen Arten zu bebildern, ersieht man, wenn man die Auflistung der DSMZ bei der Gattung Bacillus mit
237 Species und Subspecies, bei Brevibacillus (15), Geobacillus (17), Paenibacillus (110), Sporosarcina
(11) oder Virgibacillus (17) betrachtet, um nur die wichtigsten Gattungen zu nennen. Sehr viele der für
Lebensmittel untypischen Arten haben außergewöhnliche Nährstoffansprüche oder sind sonst wie ziem-
lich exotisch. Manche Arten benötigen beispielsweise Harnstoff oder viel Salz oder ausgesprochen
niedrige oder hohe pH-Werte. Diese Formen könnten sowieso nicht mit den von uns gewählten Bedin-
gungen für die FTIR-Spektroskopie-Bibliotheken (TSA bei 25 °C/24 h für Mesophile, TSA bei 55 °C/24 h
für Thermophile, BATA bei 45 °C/24 h für Alicyclobacillus, BHIA bei 30 °C/24 h für Bacillus sporother-
modurans) spektroskopiert werden, da sie auf diesen Medien untypisch krüppelig wachsen und nicht
ausreichend viel Zellmaterial liefern würden. Für diese Arten müsste man eigene, spezifische Spektren-
bibliotheken mit alternativen Kulturbedingungen erarbeiten.

Es stellt sich auch die Frage, weshalb die FTIR-Methode nicht immer eindeutige Ergebnisse liefert. Dies
hat zum einen mit gerätetechnischen Aspekten zu tun. Die meisten Spektren wurden mit dem Geräte-
modell IFS-28B (Bruker Optics) erstellt. Das Gerät hat ein Probenrad mit 15 Messpositionen. Gerade
bei den Bazillen kann oft nur jede zweite Position mit einer Keimsuspension besetzt werden, da manche
Stämme, beispielsweise von Bacillus licheniformis, so stark schleimig sind, dass deren Suspensionen
über die Begrenzungsringe der Probenfelder fließen, und benachbarte Suspensionen sich somit vermi-
schen würden. Andererseits bietet das Gerät die Möglichkeit der Spülung mit getrockneter Luft, was von
uns intensiv genutzt wurde. Wir hatten nie mehr als 10% Luftfeuchte im Gerät. Wasserdampf und Koh-
lendioxid stören die Messung erheblich. Dies mag bei chemischen Analysen unerheblich sein. Bei den
geringen spektralen Unterschieden zwischen Mikroorganismen-Arten oder -Stämmen ist dies aber ein
sehr wichtiges Kriterium. Die Unterscheidungsmöglichkeit kann ohne diese Methodenverfeinerung ver-
loren gehen. Die Fa. Bruker brachte mit dem HTS-XT ein Nachfolgegerät auf den Markt, das technische
Vorteile hat, aber auch weniger genau ist. Bei diesem Gerät kann man auf einer Infrarot-inerten Träger-
platte 96 Positionen besetzen. Dies ist bei rein chemischer Anwendung ein Vorteil gegenüber dem Vor-
gängermodell; bei der Mikrobiologie mit den etwas zeitaufwendigen Vorbereitungsarbeiten aber weniger
hilfreich. Während das IFS-28B-Gerät die 7 oder 15 Proben misst (15-20 min), können die nächsten
Keimsuspensionen vorbereitet werden. Zudem kann man beim HTS-XT-Gerät keine Spülung mit gerei-
nigter Luft vornehmen; die Trocknung erfolgt nur mit Silikagelpatronen. Die Messungen an diesem Ge-
rät sind ungenauer als die an dem IFS-28B. Der Vergleich von Spektren neuer Identifizierungsstämme,
heute gewonnen am HTS-XT-Gerät, mit der am IFS-28B erstellten Spektrenbibliothek leidet stark ge-
genüber dem früheren Vergleich von Identifizierungsspektren und Spektren der Spektrenlibrary.

Ohne Zweifel sind die Arten intern recht variabel in ihren Spektren, so dass auch dies zur Ungenauigkeit
bei der Identifizierung - sprich inhomogene Reihung oder hohe spektrale Distanz in der Hitliste - bei-
trägt. Wurden viele Stämme einer Art in die Spektrenbibliotheken einbezogen, lässt sich diese Variabili-
tät in gewisser Weise kompensieren. Dennoch kommen immer wieder Stämme vor, die sich als spektra-
le Ausreisser darstellen. Manche Arten sind sich in ihren Spektren ausgesprochen ähnlich, so dass mit
einer Durchmischung der Reihung in der Hitliste zu rechnen ist. Von einigen Arten hatten wir nur einen
Stamm; hier ist klar, dass dann diese Art nur einmal - wenn mehrere Messungen vorliegen auch mal
alle Messungen dieses Stamms - auftreten kann. Bei Arten, deren Spektren sich generell mischen,
beispielsweise bei der Gruppe Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus mojavensis und
Bacillus polyfermentans, stellt sich die Frage, inwieweit die systematische Separierung in diverse Spe-
cies gerechtfertigt ist.

Es ist also sehr ratsam, nicht blindlings dem Ergebnis der FTIR-Spektroskopie zu vertrauen. Die Hitliste
allein oder der erste Hit der Liste sollten nicht das alleinige Kriterium einer Identifizierung sein. Es emp-
fiehlt sich, zusätzlich auch noch ein Dendrogramm der Spektren der Identifizierungsstämme mit der
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Gesamt- oder einer Teilbibliothek zu Rate zu ziehen. Hierbei kann man unterschiedliche Algorithmen -
Average Linkage, Ward, 1. oder 2. Ableitung des Spektrums etc. - wählen. Zudem kann auch ein Identi-
fizierungsspektrum mit der Arten-Mittelwert-Bibliothek verglichen werden. In dieser sind die Mittelwerte
aller Spektren aller Stämme einer Art (Mittelwertspektren) abgelegt; bei spektroskopisch stark variablen
Arten können dies auch mehrere Subgruppen von Mittelwerten sein. Eine gute Alternative zur Einzel-
spektren-FTIR-Spektroskopie ist die Identifizierung mit Künstlichen Neuronalen Netzwerken (artifical
neural networks, ANNs). Zudem ist das Identifizierungsergebnis - wie oben erwähnt - mit den zell- und
koloniemorphologischen Charakteristiken zu verifizieren. In Einzelfällen kann auch auf physiologische
Eigenschaften zurückgegriffen werden. Das Wachstumsverhalten auf PEMB-Agar, Gasbildung, Katala-
se, Oxidase, VP oder die Säurebildung aus Zuckern (z. B. im API-, Vitek-, Crystal- oder Biolog-Testkit)
können solche zu testende Merkmale sein. Allerdings bedeutet auch hier, dass „positiv“ bzw. „negativ“
meist nur meint „positiv bzw. negativ für 90-100% der geprüften Stämme in diesem Taxon“ - manchmal
sogar nur 75-100%. Schlüsselmerkmale, beispielsweise ein schwarzes Pigment, verhelfen zur Identifi-
zierung von Subspecies. Für die Beurteilung der Produktschädigung müssten die Reaktionen Gelatine-,
Stärke- und Casein-Hydrolyse oder das Wachstumsvermögen bei niedrigen Temperaturen geprüft wer-
den, was nicht immer in der Literatur der Originalbeschreibungen der Fall ist.

Bleibt noch zu erwähnen, dass diese Foto-Bibliothek nicht mit Hilfe meiner Kollegen zu erledigen gewe-
sen wäre. Mein Dank gebührt insbesondere Prof. Siegfried Scherer, Dr. Mareike Wenning, Andreas
Bischof, Lisa Rieder und Gernot Rieser.
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Rechte
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Vergrößerungsmaßstab der Mikroskopbilder
Das Linienraster der folgenden Fotos beträgt 10 µ von einer Balkenunterkante zur nächsten Balkenun-
terkante.

Wenn nicht anders angegeben, wurden bei den mikroskopischen Aufnahmen folgende Einstellungen
gewählt: Objektivvergrößerung 63 x + Tubuslinsenvergößerung 1,6 x

Seltener war die Einstellung: Objektivvergrößerung 63 x + Tubuslinsenvergößerung 2,0 x

Seltener war auch die Einstellung: Objektivvergrößerung 63 x + Tubuslinsenvergößerung 1,25 x
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Seltener war auch die Einstellung: Objektivvergrößerung 63 x + Tubuslinsenvergößerung 1,0 x

Beispiel mit eingeblendetem Maßstab für Objektivvergrößerung 63 x + Tubuslinsenvergößerung 1,6 x: