Etudes de nouveaux paramètres environnementaux sur la plasticité des cellules souches

205 Pages·2017·19.97 MB·English

by  Aya Abou Hammoud

THÈSE EN COTUTELLE PRÉSENTÉE

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR DE

L’UNIVERSITÉ DE BORDEAUX

ET DE L’UNIVERSITÉ LIBANAISE

ÉCOLE DOCTORALE UBX

ÉCOLE DOCTORALE DU LIBAN

SPÉCIALITÉ : BIOLOGIE CELLULAIRE ET PHYSIOPHATOLOGIE

Par Aya ABOU HAMMOUD

ETUDES DE NOUVEAUX PARAMETRES
ENVIRONNEMENTAUX SUR LA
PLASTICITE DES CELLULES SOUCHES

EMBRYONNAIRES MURINES

Sous la direction de Dr. Héléne BOEUF

et de Pr. Mohamad MORTADA
Soutenue le 17 Décembre 2015
Membres du Jury
M. Fabrice Lalloué, Professeur, EA3842, Faculté de médecine Limoges Président

M. John de Vos, Docteur, Ingénierie cellulaire et tissulaire, Université de Montpellier Rapporteur
M. Wissam Faour, Professeur, Faculté de médecine, Lebanese Amercican University Rapporteur
M. Bassam Badran, Docteur, PRASE, Université Libanaise Examinateur

M. Mohamad Mortada, Professeur, Lab d'immunologie, Université Libanaise Directeur
Mme. Héléne Boeuf, Docteur, UMR-CNRS-5164-CIRID, Université de Bordeaux Directrice
« No progress through improving what is already
done, but striving to achieve what remains to be done »
Gibran Khalil Gibran

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Titre: Etudes de nouveaux paramètres environnementaux sur la
plasticité des cellules souches embryonnaires murines (mESC)
Résumé: Les cellules souches embryonnaires (ESCs) sont dérivées d'embryons au stade
blastocyste. Elles sont caractérisées par la capacité de se diviser et de maintenir un phénotype
indifférencié et en présence de stimuli, de se différencier en cellules spécialisées dérivées des trois
feuillets embryonnaires, c'est la pluripotence. Elles sont un outil puissant pour modéliser des maladies
génétiques à des fins de découvertes en recherche fondamentale et aussi dans un but d’applications
cliniques.
Les mESCs sont maintenues pluripotentes in vitro en présence de LIF (Leukemia Inhibitor Factor),
une cytokine de la famille des Interleukines 6 (IL6) présentant des effets pléïotropes en fonction du
type et de la maturité cellulaire. Le retrait de LIF conduit à la différenciation hétérogène des mESCs
dont une partie meurt par apoptose. Lors du retrait de LIF, les cellules entrent séquentiellement dans
des phases d'engagement réversible (jusqu'à 36h après retrait du LIF) et irréversible, au cours
desquelles la re-stimulation par le LIF induit des effets différents. Afin de mieux caractériser cet effet
de LIF, nous avons mis au point un « test de plasticité » in vitro et avons étudié l'impact de paramètres
environnementaux qui pourraient moduler cette plasticité dans les mESCs. Nous avons montré que la
MMP1 (Matrix Metalloproteinase 1), qui peut remplacer le LIF dans le maintien de la pluripotence,
est moins efficace pour le maintien de la plasticité cellulaire des mESCs. Nous avons aussi montré que
les mESCs restent pluripotentes et plastiques à 3% d'O , in vitro, et qu’elles se caractérisent par un
2
nouvel équilibre d'expression des gènes et des protéines en comparaison à 20% d'O .
2
Mots clés: mESCs; plasticité cellulaire; paramètres environnementaux.
Title: Studies of new environmental parameters on murine
embryonic stem cell plasticity
Abstract : Embryonic Stem Cells (ESCs) are derived from embryo at the blastocyst stage. These
cells are characterized by their properties of self-renewal and pluripotency: ability to divide and
maintain an undifferentiated phenotype and to differentiate into specialised cells of the three primary
germ layers in the presence of stimuli. ESCs are a powerful tool to modelize genetic diseases for
fundamental research and clinical applications.
Mouse Embryonic Stem Cells (mESCs) are maintained pluripotent in vitro in the presence of
Leukemia Inhibitory Factor (LIF), an Interleukin 6 (IL6) cytokine family member which displays
pleiotropic functions, depending on both maturity and type of cells. LIF withdrawal leads to
heterogeneous differentiation of mESCs and part of the differentiated cells die by apoptosis. During
the kinetics of LIF withdrawal, we show that cells enter a LIF-dependent reversible (up to 36h of LIF
withdrawal) and irreversible phase of differentiation in which LIF-restimulation induces differential
effects. To better characterize this period and LIF-dependent processes, we setted up an in vitro «
plasticity test » and investigated the impact of environmental parametrs that could regulate cell
plasticity in mESCs. Our results reveal that the Matrix Metalloproteinase 1 (MMP1), which can
replace LIF cytokine for maintenance of mESCs pluripotency, mimics its effects in the plasticity
window, but with less efficiency. In addition, we demonstrate that mESCs maintain plasticity and
pluripotency potentials in vitro, under 3% O (physioxic condition) with a new equilibrium of gene
2
and protein expression levels compared to 20% O .
2
Key words: mESCs; cell plasticity; environmental parameters.
Unité de recherche
[Composantes Innées de la Réponse immunitaire et Différenciation, UMR-CNRS-5164, 146 Rue léo
saignat 33076 BORDEAUX CEDEX]
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DEDICACES

Afin d’être reconnaissante envers ceux qui m’ont appuyée et encouragée à
effectuer ce travail de recherche, je dédie ce mémoire :

À ma très chère grand-mère Hajeh Raîfeh pour son soutien moral, et pour tous
les sentiments d'affection et d’amour.

À ma très chère mère Sultana et à mon très cher père Ismail qui n’ont cessé de
me combler par leur soutien, leur amour et leur tendresse qui représentent pour
moi le pilier de tous mes efforts.

À tous les membres de ma famille.
Et à tous ceux que ma réussite tient à coeur.

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REMERCIEMENTS
Cette thèse de Doctorat a été réalisée dans le cadre d’une convention de cotutelle entre
l'école doctorale des Sciences et Technologie (EDST) de l'université Libanaise et l'école
doctorale de l'université de Bordeaux.
Par ces quelques lignes, je tiens à remercier toutes les personnes qui ont participé de
près ou de loin au bon déroulement de cette thèse, en espérant n’avoir oublié personne…
Je tiens à remercier tout particulièrement ma directrice de thèse française Dr. Hélène
Boeuf (responsable du groupe Cellules Souches au sein de l'unité CNRS-UMR-5164-CIRID)
d'avoir bien assuré la direction et l'encadrement de mes travaux de thèse. Merci pour votre
gentillesse, votre patience et vos précieux conseils. J'ai beaucoup apprécié travailler à vos
côtés tant sur le plan scientifique que sur le plan humain. Je garde toujours beaucoup de
plaisir à discuter avec vous et à bénéficier de vos conseils.
Je tiens à remercier spécialement mon directeur de thèse libanais Pr. Mohamad
Mortada (Laboratoire d'immunologie Moléculaire et signalisation cellulaire à l'université
Libanaise) d'avoir cru en mes capacités, pour le temps et la patience que vous m’avez
accordés tout au long de ces années en me fournissant d'excellentes conditions logistiques. Je
garderai dans mon coeur votre générosité, votre compréhension et votre efficacité. Pour tout
ce que vous m'avez donné, je vous remercie très sincèrement.
Je tiens à remercier ma co-directrice de thèse libanaise Dr. Dana Zeineddine à qui
j'adresse mes remerciements les plus sincères pour sa disponibilité, ses aides, ses conseils et
ses encouragements.
Je tiens à remercier Mr. le professeur Jean-François Moreau pour m'avoir accueillie au
sein de son unité.
Je remercie les membres du jury d'avoir accepté d'évaluer mon travail de thèse:
M. le professeur Fabrice Lalloué (EA3842, Homeostasie Cellulaire et Pathologies) de la
faculté de médecine-Limoges pour avoir accepté de présider ce jury.
M. le Professeur Wissam Faour de la faculté de médecine-Lebanese Amercican University
(LAU) et M. le docteur John de Vos (Département d'ingénierie cellulaire et tissulaire) de
l'université de Montpellier pour m'avoir fait l'honneur d'être rapporteurs de ce travail.
M. le docteur Bassam Badran (PRASE, Platforme de Recherche et d'Analyse en Sciences de
l'Environnement) de l'université Libanaise pour m'avoir fait l'honneur d'être examinateur de
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ce travail. Je vous remercie pour votre générosité et vos qualités humaines. Je vous adresse
mes sentiments les plus respectueux.
Je remercie très chaleureusement Dr.Wassim Abou Kheir (Faculté de médecine à
l'American University of beirut-AUB) pour son soutien, ses aides, ses précieux conseils, sa
générosité et ses qualités humaines. Un grand merci aux membres de son équipe: Rabih,
Alissar, Layal et Ola.
Je tiens à remercier également les membres de la plateforme PRASE surtout Dr.
Nabil el Zein et Zeinab pour leurs aides et leurs soutiens.
Je remercie aussi vivement la Fondation HARIRI, Beyrouth, qui m’a accordé une
bourse de Doctorante pour les travaux réalisés en France.
Je tiens également à remercier tous les membres de l'équipe de Mr. Pierre Thiebaud.
Merci à Pierre pour ses précieux conseils et sa sympathie. Un très grand merci à Sandrine,
ma meilleure amie, pour sa bonne humeur communicative, sa gentillesse, son soutien moral et
tous ses encouragements. Un très grand merci aussi à Corinne pour sa disponibilité, ses aides,
son soutien et sa gentillesse. Par ailleurs, Je n'oublierai pas nos discussions scientifiques, ses
remarques pertinentes et ses précieux conseils. Sans oublier Philippe et Karine pour leur
soutien. Je remercie aussi mes chères amies: Alice, Emilie et Héléna pour leur présence
agréable, leur soutien et leur aide.
Je remercie Xavier pour ses conseils, son aide technique ponctuelle, sa disponibilité et
pour toutes nos discussions animées partagées au cours de ma thèse.
Je remercie Camille pour son aide, sa disponibilité et ses encouragements et Marine
pour son aide et sa gentillesse.
Je tiens ègalement à remercier les membres de l'équipe de Mr. Vincent praloran,
notamment Arnaud pour sa disponibilité, sa gentillesse et ses conseils avisés.
Je remercie Vincent et Santiago pour leur aide en cytométrie et Sophie pour ses aides
et ses conseils en biochimie.
Je remercie aussi Annie pour son soutien administratif et Aurélie pour ses aides et ses
encouragements illimités. Je n'oublierai pas nos bons moments durant les pauses déjeuners
avec Sandrine.
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J'adresse également tous mes remerciements aux membres du laboratoire avec qui j’ai
interagis lors de cette thèse pour l'atmosphère agréable qu'ils contribuent à maintenir au sein
de l'unité CNRS-UMR-5164-CIRID.
Un très grand merci à mes amis de Bordeaux: Osman, Faten, Montaha, Karim, Najwa,
Mohamad-Ali, Liliane, Bourak, Layal, Hussein, Hasan, Maria, Ahmad et Haytham. Merci
aussi pour mes amis de Nantes: Diana, Dalia, Nadine, Farah, Joanna, Ali A, Ali R, Ali G, Ali
A, Nader, Ghassan, Alaa, Ahmad, Jaafar, Houssam et Sary pour leur aide et leur soutien avec
mes meilleurs souhaits de réussite pour leur vie professionnelle et personnelle.

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Tables des matières

Tables des matières ............................................................................................ 7
Sommaire ........................................................................................................... 12
Liste des abréviations ........................................................................................ 16
INTRODUCTION ............................................................................................. 21
I. Généralités ................................................................................................................... 21
II. La cellule Souche ......................................................................................................... 24
A. Historique .................................................................................................................. 24
B. Qu'est-ce qu'une Cellule souche ? ............................................................................. 25
1. Les cellules souches totipotentes ........................................................................... 26
2. Les cellules souches pluripotentes ......................................................................... 27
3. Les cellules souches multipotentes ........................................................................ 27
4. Les cellules souches unipotentes ........................................................................... 28
C. Le microenvironnement des cellules souches ........................................................... 29
1. Qu’est-ce qu’une niche ? ....................................................................................... 29
2. Fonctions et compositions ...................................................................................... 29
D. Les cellules souches « pathologiques » ..................................................................... 31
E. Les cellules souches pluripotentes ............................................................................. 34
1. Les différents types de cellules souches pluripotentes .......................................... 34
1.1. Les Cellules Souches Embryonnaires (ESCs) ................................................ 34
1.1.1 Les tératocarcinomes ou cellules de Carcinomes Embryonnaires (ECs) .... 34
1.1.2 Les Cellules Souches Embryonnaires murines (mESCs) ........................... 35
i Caractéristiques des mESCs ....................................................................... 37
ii Mise en évidence de la pluripotence dans les ES murines : in vitro et in
vivo 38
iii Culture in vitro des mECSs: capacité d'auto-renouvellement..................... 39
1.1.3 Les ESCs dans le modèle humain (hESCs) ................................................ 42
i Caractéristiques des hESCs ......................................................................... 42
ii Culture in vitro des hECSs: maintien de l'auto-renouvellement ................. 43
1.1.4 Les Cellules Souches Epiblastiques dans le modèle murin (mEpiSCs) ..... 44
i Caractéristiques des mEpiSCs .................................................................... 44
ii Culture in vitro des mEpiSCs: maintien de l'auto-renouvellement ............. 45
1.1.5 Les Cellules Souches embryonnaires germinales (EGC) et PGCs ............. 45
1.2. Les Cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) ...................................... 46
2. Les différents états de pluripotence ....................................................................... 47
8
2.1. Etat fondamental ou état ground de la pluripotence ....................................... 48
2.2. Etat naïf de la pluripotence ............................................................................. 50
2.2.1 Origine et établissement de l'état naïf de la pluripotence ........................... 50
2.2.2 Etat naïf de la pluripotence, un état métastable et hétérogène .................... 51
2.2.3 Plasticité et hétérogénéité de l'état naïf ....................................................... 54
2.3. Etat engagé ou primed de la pluripotence ...................................................... 57
2.4. Caractérisation intrinsèque des états naïfs et primed de la pluripotence ........ 58
2.4.1 Le noyau de la pluripotence ........................................................................ 59
i. OCT4 . ........................................................................................................ 59
ii. SOX2 ........................................................................................................... 60
iii. NANOG ...................................................................................................... 60
2.4.2 Le réseau de la pluripotence naïve .............................................................. 61
i. KLF2, KLF4 et KLF5 ................................................................................. 61
ii. SALL4 ......................................................................................................... 62
iii. GBX2 .......................................................................................................... 63
iv. ESRRβ ........................................................................................................ 63
2.4.3 Les marqueurs de l'état primed de la pluripotence...................................... 64
2.5. Caractéristiques extrinsèques des états naïf et primed de la pluripotence ...... 64
2.5.1 Les voies de signalisation induites par le LIF ............................................. 64
i. Voie JAK1/STAT3/SOCS3 ........................................................................ 65
ii. Voie SHP2/RAS/MAPK ............................................................................. 66
iii. Voie PI3K ................................................................................................... 66
2.5.2 Synergie avec la voie LIF ........................................................................... 69
i. La voie BMP4. ............................................................................................ 69
ii. La voie WNT .............................................................................................. 69
2.6. Caractéristiques fonctionnelles des états naïf et primed de la pluripotence ... 70
2.7. Caractéristiques métaboliques des états naïf et primed de la pluripotence .... 71
2.8. L’état intermédiaire de la pluripotence ........................................................... 72
2.8.1 Isolement des IESC ..................................................................................... 72
2.8.2 Les caractéristiques moléculaires ............................................................... 73
2.8.3 Les caractéristiques fonctionnelles ............................................................. 73
2.9.2 La plasticité cellulaire: Balance entre les mESCs naïves et les EpiSCs primed
.........................................................................................................................75
2.9.1 La Conversion : état naïf vers état primed (ICM/mESCs vers EpiSCs) . 75
9
2.9.2 La Réversion: état primed vers état naïf (Epiblaste/EpiSCs vers mESCs)
..................................................................................................................77
III. Le LIF: Leukemia Inhibitor Factor .......................................................................... 78
A. Historique et Généralités ........................................................................................... 78
1. Historique ............................................................................................................... 78
2. Généralités sur le LIF ............................................................................................. 79
B. LIF et son récepteur : gp130 et gp190 ....................................................................... 80
C. La signalisation LIF ................................................................................................... 81
D. LIF et le développement embryonnaire ..................................................................... 83
E. LIF et les ESCs .......................................................................................................... 83
IV. La MMP1 (Matrix MetalloProteinase 1) .................................................................. 87
A. Généralités ................................................................................................................. 87
B. MMP1 et les ESCs ..................................................................................................... 89
V. Hypoxie ......................................................................................................................... 90
A. Généralités ................................................................................................................. 90
B. Le complexe HIF ....................................................................................................... 91
C. Mécanisme de régulation de HIF1α par l'oxygène .................................................... 93
E. Les cibles de l’hypoxie .............................................................................................. 95
F. Hypoxie et les ESCs .................................................................................................. 95
VI. Quelles sont les applications de la recherche sur les cellules souches (SCs)? ........ 97
A. Intérêts pour la recherche fondamentale .................................................................... 97
B. Intérêts pour le domaine de la santé .......................................................................... 98
VII. Objectifs de travail ...................................................................................................... 99

MATERIELS ET METHODES ............................................................................ 100
I. Culture cellulaire ....................................................................................................... 100
A. Entretien des cellules ............................................................................................... 100
B. Traitement des mESCs avec U0126, SU5402 et CHIR99021................................. 100
C. Mise en évidence de la Phosphatase Alcaline (AP) ................................................ 102
D. Analyse de la prolifération ...................................................................................... 102
E. Test de la pluripotence : Capacité de différenciation in vitro en Corps Embryoïdes
(EBs) ............................................................................................................................... 103
F. Transfection cellulaire ............................................................................................. 103
II. RT-qPCR .................................................................................................................... 104
A. Extraction d’ARN .................................................................................................... 104
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