Estudio de variabilidad genética en poblaciones de cedro de montaña y porotón con marcadores ...

168 Pages·2015·3.44 MB·English

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE
LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

TESIS PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA

AUTOR: DANIELA CECILIA SANTAMARÍA AYALA

TEMA: ESTUDIO DE VARIABILIDAD GENÉTICA EN
POBLACIONES DE CEDRO DE MONTAÑA (Cedrela montana J.
Moritz ex Turczaninov) Y POROTÓN (Erithryna edulis Triana ex
Michaelli) CON MARCADORES SSR (Simple Sequence Repeats) e
ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)

DIRECTORA: DRA. KARINA PROAÑO
CODIRECTOR: ING. MARCO TAIPE
SANGOLQUÍ
2015
ii

CERTIFICACIÓN

Dra. Karina Proaño Ing Marco Taipe

Certifican:

Que el trabajo titulado “ESTUDIO DE VARIABILIDAD GENÉTICA EN
POBLACIONES DE CEDRO DE MONTAÑA (Cedrela montana J. Moritz ex
Turczaninov) Y POROTÓN (Erithryna edulis Triana ex Michaelli) CON
MARCADORES SSR (Simple Sequence Repeats) e ISSR’S (Inter-Simple Sequence
Repeat)”, realizado por la Srta. Daniela Cecilia Santamaría Ayala, ha sido guiado y
revisado periódicamente y cumple con las normas estatuarias establecidas por la
UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE, en el Reglamento de
Estudiantes de la misma.

Debido a que fue realizada de manera muy responsable, confiable y con resultados
interesantes para la ciencia, si recomiendan su publicación.
El mencionado trabajo consta de un documento empastado y un disco compacto, el
cual contiene los archivos en formato portátil de Acrobat (PDF). Autorizan a
DANIELA CECILIA SANTAMARIA AYALA que lo entregue a DRA. MARÍA
AUGUSTA CHÁVEZ LARREA, en su calidad de Coordinadora de la Carrera de
Ingeniería en Biotecnología.
Sangolquí, Junio de 2015.

Dra. Karina Proaño Ing. Marco Taipe
DIRECTORA CODIRECTOR
iii

DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD

Daniela Cecilia Santamaría Ayala

Declaro que:

El proyecto de grado titulado “ESTUDIO DE VARIABILIDAD GENÉTICA EN
POBLACIONES DE CEDRO DE MONTAÑA (Cedrela montana J. Moritz ex
Turczaninov) Y POROTÓN (Erithryna edulis Triana ex Michaelli) CON
MARCADORES SSR (Simple Sequence Repeats) e ISSR’S (Inter-Simple Sequence
Repeat)”, ha sido desarrollado con base a una investigación exhaustiva, respetando
derechos intelectuales de terceros, conforme las citas que constan en el escrito
correspondiente, cuyas fuentes se incorporan en la bibliografía. Consecuentemente el
presente trabajo de investigación es de mi autoría.

En virtud de esta declaración, me responsabilizo del contenido, veracidad y alcance
científico del proyecto de grado en mención.

Sangolquí, Junio de 2015

Daniela Cecilia Santamaría Ayala
iv

AUTORIZACIÓN

Yo, Daniela Cecilia Santamaría Ayala

En calidad de autor principal, previo consentimiento, autorizo la publicación del
trabajo: “ESTUDIO DE VARIABILIDAD GENÉTICA EN POBLACIONES DE
CEDRO DE MONTAÑA (Cedrela montana J. Moritz ex Turczaninov) Y
POROTÓN (Erithryna edulis Triana ex Michaelli) CON MARCADORES SSR
(Simple Sequence Repeats) e ISSR’S (Inter-Simple Sequence Repeat)”, cuyo
contenido, ideas y criterios son de mi exclusiva responsabilidad y autoría.
Considerando a las instituciones y a los colaboradores mencionados en el presente
estudio.

Sangolquí, Junio de 2015.

Daniela Cecilia Santamaría Ayala
v

DEDICATORIA

“Los ideales que han iluminado mi camino han sido la bondad, la belleza y la
verdad”.
Albert Einstein
A mi Dios, mi roca, fortaleza en cada paso de mi vida, mi guía, origen de
amor y bondad.
A mi familia, mis padres, y mi hermana, que son mi apoyo, alegría y mayor
ejemplo de tenacidad en mi vida, luz de mis días.
A mis abuelitos y tíos Anita, Carmita, Aracely, Cristian y Carlitos, seres
mágicos que iluminan mi vida con su alegría y amor, por ser mi mayor ejemplo de
esfuerzo, entereza, y valentía frente a la vida.
A los amigos verdaderos, que han sido mis confidentes en las buenas y malas,
llenando mi vida de esperanza.

Daniela
vi

AGRADECIMIENTO
Ante todo a Dios, por ser mi norte, mi centro, mi mano amiga y apoyo
incondicional.
A mis ángeles de la guarda en la tierra, mis padres, seres ejemplares, su
energía, apoyo y comprensión han convertido lo aparentemente imposible en posible.
A mi madre Marcy, mujer ejemplo de todo lo que quiero y voy a ser en mi
vida, gracias por tu, apoyo, ternura, amor y por no dejarme sola ni un momento.
A mi padre Jorge, hombre integro, tu fortaleza ha sido mi fortaleza, mi lucha
ha sido tu lucha mía. Se cumple lo que me dices siempre “la constancia es la virtud
por la que todas las cosas dan su fruto” (Arturo Graf), y ahora lo entiendo. Gracias
por ser como eres.
A la gran complice de mi vida, mi hermana Dianita, un gran apoyo en mi
camino, un ejemplo de tenacidad y cariño. Gracias por tu preocupación por mí, tus
travesuras y locuras, hicieron más llevadera esta travesía.
Los más sinceros agradecimientos al Instituto Nacional Autónomo de
investigaciones Agropecuarias –INIAP y a Secretaría Nacional de Educación
Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación – SENESCYT, ya que prestaron apoyo y
financiamiento, al desarrollo de este proyecto, como parte de dos grandes estudios en
desarrollo: “Conservación y Uso Sostenible de Recursos Genéticos Forestales en
áreas críticas de bosques húmedos y secos de los Andes y Amazonía” y “Desarrollo
e innovación biotecnológica para la potenciación de rubros agrícolas de importancia
en seguridad alimentaria, competitividad exportable y adaptación al cambio
climático”.
Agradezco al Departamento Nacional de Biotecnología (DNB), por medio del
Dr. Eduardo Morillo, jefe del Departamento, gracias por la confianza, guía y ayuda
prestadas en el desarrollo de esta tesis. En especial mi agradecimiento a la Ing.
Johanna Buitrón (Joha), por la paciencia, apoyo, guía y compresión en el laboratorio,
muchas gracias de corazón. No quiero dejar de agradecer a Ing. Verónica Bonilla por
el apoyo prestado en el momento oportuno. Y al resto del personal del departamento
vii

gracias por todo, por su compañerismo y amistad, Sory, doña Maricita, y doña Geo,
se las quiere y aprecia por como son, grandes personas y por su labor diaria.
Al Programa Nacional de Forestería, al Dr. Eduardo Grijalva e Ing. Raúl
Rámos, líderes del departamento por la confianza depositada en mí para este
proyecto. Y al personal del departamento por el apoyo en la recolección de las
muestras vegetales. A Paulina Lara y Silvana Ortiz, por el apoyo incondicional
prestado.
A la universidad, que fue testigo de cada logro conseguido, la gloriosa
“ESPE” Universidad de las Fuerzas Armadas, en especial a la Carrera de Ingeniería
en Biotecnología.
A mi Directora Dra. Karina Proaño y Codirector Ing Marco Taipe, quienes
permitieron que finalice este trabajo con éxito.
A mis grandes maestros y amigos, no solo profesionalmente si no como seres
humanos, Ing. Leonardo Beltrán, Ing. Diana Vaca, Ing. María José Grijalva e Ing
Cristian Dumán.
A mis grandes compañeros incansables del camino Darwin, Jacky, Ely, Eve,
Stefy, Majito, Katy, Jairito, Gabo, Javi, gracias por el apoyo en esas noches
interminables de tareas, por esas palabras de aliento o simplemente su presencia en
esos días difíciles, por ser como son.
viii

ÍNDICE DE CONTENIDOS
CERTIFICACIÓN ....................................................................................................... ii
DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD ............................................................ iii
AUTORIZACIÓN ...................................................................................................... iv
DEDICATORIA .......................................................................................................... v
AGRADECIMIENTO ................................................................................................ vi
RESUMEN ................................................................................................................. xx
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN ............................................................................... 1
1.1. Formulación del Problema ............................................................................ 1
1.2. Justificación ................................................................................................... 2
1.3. Objetivos de Investigación ............................................................................ 4
1.3.1. Objetivo General .................................................................................... 4
1.3.2. Objetivos Específicos ............................................................................. 4
1.4. Marco Teórico ............................................................................................... 4
1.4.1. Generalidades de las especies forestales ................................................ 4
1.4.2. Género Cedrela ...................................................................................... 7
1.4.3. Género Erythrina ................................................................................... 9
1.4.4. Importancia de la conservación de las especies nativas ....................... 12
1.4.5. Marcadores morfológicos.................................................................... 12
1.4.6. Marcadores moleculares........................................................................... 13
1.5. Hipótesis ...................................................................................................... 20
 Ho1: ............................................................................................................. 20
 Ho2: ............................................................................................................. 20
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................... 21
2.1. Participantes .................................................................................................... 21
2.1.1. Instituciones ............................................................................................. 21
2.1.2. Colaboradores científicos ......................................................................... 21
2.2. Zona de Estudio............................................................................................... 22
2.2.1. Fase de Campo ......................................................................................... 22
2.2.2. Fase de Laboratorio .................................................................................. 23
2.3. Período de Investigación ................................................................................. 23
2.4. Análisis de Datos ............................................................................................ 24
2.4.1. Diversidad genética .................................................................................. 24
2.4.2. Estructura genética ................................................................................... 29
2.4.3. Medida de diversidad genética entre poblaciones ................................... 31
ix

2.5 Procedimiento .................................................................................................. 34
2.5.1. Obtención de material vegetal .................................................................. 34
2.5.2. Extracción de ADN genómico ................................................................. 34
2.5.3. Cuantificación de ADN ............................................................................ 36
2.5.4. Validación de las muestras ....................................................................... 37
2.5.5. Amplificación de marcadores microsatélites (SSR) con la técnica M-13
tailing para el genotipaje de C. montana en el Analizador Genético LI-COR
4300 .................................................................................................................... 40
2.5.6. Genotipaje de C. montana en el analizador LI-COR 4300 ..................... 43
2.5.7. Amplificación de marcadores Inter Secuencias Simples Repetidas (ISSR)
con la técnica PCR simple para el genotipaje de C. montana y E. edulis .......... 44
2.5.8. Genotipaje en el programa Photocapt Molecular Weight Version 10.01
(1999-2001) de C. montana y E. edulis ............................................................. 45
3.1. Caracterización molecular de C. montana con SSR e ISSR ........................... 47
3.1.1. Análisis de diversidad genética de C. montana ....................................... 51
3.1.2. Estructura Genética .................................................................................. 65
3.1.3. Análisis Molecular de Varianza ............................................................... 92
3.2. Caracterización molecular de E. edulis con ISSR ........................................... 93
3.2.1. Análisis de diversidad genética de E. edulis ............................................ 97
3.2.2. Estructura Genética ................................................................................ 100
3.2.3. Análisis Molecular de Varianza ............................................................. 106
CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN ................................................................................. 107
4.1. Diversidad Genética C. montana .................................................................. 107
4.2. Diversidad Genética de E. edulis .................................................................. 115
4.3. Implicaciones en la conservación.................................................................. 119
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES.......................................................................... 121
CAPÍTULO VI: RECOMENDACIONES ............................................................... 124
CAPÍTULO VII: BIBLIOGRAFÍA ......................................................................... 125
ANEXOS ................................................................................................................. 139
Anexo A. Registros de Muestras de Porotón (E. Edulis) y Cedro (C. Montana), y
Cuantificaciones de su ADN. Parte 1 .................................................................. 139
Anexo B. Matrices Genotípicas de cedro (C. montana) y porotón (E. edulis) .... 141
B.1. Matriz Genotípica de cedro (C. montana) al evaluar con 4 marcadores
codominantes (SSR) mediante el programa SAGA GT MICROSATELLITE
V3.3. Parte 1. .................................................................................................... 141
Anexo C. Registros de Frecuencias Alélicas de cedro (C. montana) con
marcadores SSR e ISSR, para las localidades de Quijos y Austro, obtenido con el
programa GenAlex V6.501. ................................................................................. 144
x

C. 1. Registro de frecuencias Alélicas en la especie C. montana para el locus
SSR presentes para estudio de variabilidad genética en la localidad de Quijos.
.......................................................................................................................... 144
C. 2. Registro de frecuencias Alélicas en la especie C. montana para el locus
SSR presentes para estudio de variabilidad genética en la localidad de Austro.
.......................................................................................................................... 145
C. 3. Registro de frecuencias Alélicas en la especie C. montana para el locus
ISSR presentes para estudio de variabilidad genética en la localidad de Quijos
.......................................................................................................................... 146
C. 4. Registro de frecuencias Alélicas en la especie C. montana para el locus
ISSR presentes para estudio de variabilidad genética en la localidad de Austro
.......................................................................................................................... 147