Estudio de los efectos cardiovasculares y la absorción oral del hidroxitirosol en modelos animales

201 Pages·04.34 MB·Spanish

TESIS DOCTORAL

Estudio de los efectos cardiovasculares y la
absorción oral del hidroxitirosol en modelos
animales y humanos.

Maria Pilar González Santiago

Granada, 2005

Estudio de los efectos cardiovasculares y la absorción
oral del hidroxitirosol en modelos animales y humanos.

Memoria que presenta la Lda. María Pilar
González Santiago para aspirar al grado de
Doctor en Farmacia por la Universidad de
Granada

Los trabajos de investigación que se exponen en esta Memoria de Tesis Doctoral han sido
realizados en el Departamento de Nutrición y Salud de Puleva Biotech S.A. bajo la dirección de
los doctores D. Eduardo López-Huertas León y D. Juristo Fonollá Joya, bajo la tutela del Dr.
C.U. Antonio Zarzuelo Zurita, del departamento de Farmacología de la Universidad de
Granada.

Dr. Eduardo López-Huertas Dr. Juristo Fonollá Dr. C.U. Antonio Zarzuelo
León Joya Zurita

Universidad de Granada Puleva Biotech S.A.
Dto. de Farmacología Dto. de Nutrición y Salud

La presente Memoria de Tesis ha sido realizada
en las instalaciones de Puleva Biotech S.A.,
gracias a la concesión de una beca predoctoral
de la Fundación Universidad-Empresa (2001-
2005) de la Universidad de Granada.

INDICE

INDICE ................................................................................................................................I

ABREVIATURAS...............................................................................................................IV

1. JUSTIFICACIÓN.............................................................................................................1

2. OBJETIVOS....................................................................................................................5

3. INTRODUCCIÓN............................................................................................................9

3.1. La enfermedad cardiovascular y sus factores de riesgo.....................................11

3.2. Fisiopatología de la aterosclerosis......................................................................14

3.3. Lipoproteínas plasmáticas y aterosclerosis.........................................................20

3.4. Teoría de la oxidación de la LDL.........................................................................22

3.5. Antioxidantes y enfermedad cardiovascular........................................................26

3.6. Dieta mediterránea..............................................................................................32

3.7. Aceite de oliva......................................................................................................33

3.8. Hidroxitirosol........................................................................................................36

3.8.1. Propiedades del hidroxitirosol descritas en modelos in vitro.....................38
3.8.2. Estudios en animales de experimentación.................................................41
3.8.3. Estudios en humanos.................................................................................43
3.8.4. Estudios de toxicidad con hidroxitirosol en animales.................................47
3.8.5. Estudios de absorción y metabolismo del hidroxitirosol............................47

4. MATERIALES Y MÉTODOS.........................................................................................51

4.1. Material y aparatos..............................................................................................53
4.1.1. Aparatos de uso general............................................................................53
4.1.2. Animales de experimentación....................................................................54
4.1.2.1. Conejos.........................................................................................54
4.1.2.2. Ratas.............................................................................................54
4.1.2.3. Ratones.........................................................................................55
4.1.3. Dietas.........................................................................................................55
4.1.3.1. Dietas de conejos..........................................................................55
4.1.3.2. Dietas de ratones..........................................................................57
4.1.4. Obtención de hidroxitirosol.........................................................................57
4.1.4.1. Síntesis química............................................................................57
4.1.4.2. Purificación a partir de alpeorujo...................................................57

4.2. Métodos...............................................................................................................58

4.2.1.. Diseños experimentales............................................................................58
4.2.1.1. Efectos del hidroxitirosol en un modelo experimental de
aterosclerosis inducida por dieta................................................................58
4.2.1.2. Estudio de absorción del hidroxitirosol en ratas...........................60
4.2.1.3. Estudio de biodisponibilidad del hidroxitirosol en humanos y su
afinidad in vivo a la LDL.............................................................................60
I
4.2.1.4. Estudio del efecto del hidroxitirosol sobre la expresión génica de
ratones........................................................................................................62

4.2.2. Obtención de muestras..............................................................................63
4.2.2.1 Obtención de plasma......................................................................63
4.2.2.2. Aislamiento de lipoproteínas LDL..................................................63

4.2.3. Métodos analíticos.....................................................................................65
4.2.3.1. Grasa total de las dietas................................................................65
4.2.3.2. Análisis de los ácidos grasos de la dieta.......................................65
4.2.3.3. Análisis de la pureza y concentración de hidroxitirosol en los
extractos y soluciones acuosas..................................................................66
4.2.3.4. Determinación de ácidos grasos en plasma.................................68
4.2.3.5. Determinación de colesterol total..................................................69
4.2.3.6. Determinación de triglicéridos.......................................................70
4.2.3.7. Determinación de colesterol HDL..................................................70
4.2.3.8. Determinación de capacidad antioxidante del plasma..................71
4.2.3.9. Determinación de malondialdehido en plasma.............................72
4.2.3.10. Análisis histológico de aortas......................................................73
A) Tinciones histológicas de las secciones de arteria.........................73
B) Estudio del análisis morfométrico....................................................74
4.2.3.11. Determinación de hidroxitirosol y metabolitos derivados............75
A) Preparación de la muestra y derivatización....................................75
B) Análisis cromatográfico...................................................................76
C) Preparación de las curvas de calibración y muestras control.
Validación del método......................................................................80
D) Expresión de los resultados............................................................83
4.2.3.12. Determinación de las constantes farmacocinéticas....................83
4.2.3.13. Determinación de la resistencia a la oxidación de lipoproteínas
LDL o “lag time”................................................................................84
4.2.3.14. Determinación de proteínas........................................................85
4.2.3.15. Determinación de apolipoproteínas B y A1.................................86
4.2.3.16. Electroforesis de lipoproteínas en gel de agarosa......................86
4.2.3.17. Obtención del ARN......................................................................86
A) Extracción........................................................................................86
B) Limpieza..........................................................................................87
C) Cuantificación..................................................................................87
D) Electroforesis de ARN en gel de agarosa.......................................88
4.2.3.18. Análisis de la expresión génica de os ARN de ratón con el
sistema microarray...........................................................................88
A) Obtención de ARN marcado con biotina.........................................88
B) Hibridación del test de prueba.........................................................90
C) Hibridación del ARN marcado con biotina con los microchips y
lectura de los datos obtenidos.............................................................90
4.2.3.19. Análisis estadístico de los resultados..........................................91

4.3. Consideraciones éticas........................................................................................92

5. RESULTADOS..............................................................................................................95
5.1. Efectos del hidroxitirosol en un modelo experimental de aterosclerosis inducida
por dieta......................................................................................................................97
5.1.1. Adaptación de los animales a la dieta........................................................97
5.1.2. Examen macroscópico...............................................................................98
5.1.3. Perfil de ácidos grasos en plasma.............................................................99
5.1.4. Composición lipídica del plasma..............................................................101
5.1.5. Concentración de peróxidos del plasma..................................................103
5.1.6. Capacidad antioxidante del plasma.........................................................104
5.1.7. Análisis histológico y morfométrico de la aorta........................................105

5.2. Estudio de la absorción del hidroxitirosol en ratas............................................110
II
5.3. Estudio de la absorción de hidroxitirosol en humanos......................................115
5.3.1. Concentración plasmática de hidroxitirosol y sus metabolitos derivados
en plasma...........................................................................................................115
5.3.2. Excreción de HT y sus metabolitos por orina...........................................120
5.3.3. Parámetros de oxidabilidad del plasma y LDL.........................................122
5.3.4. Capacidad antioxidante de los metabolitos del HT..................................123

5.4. Estudio de la afinidad del hidroxitirosol por las lipoproteínas LDL....................125
5.4.1. Caracterización del gradiente de lipoproteínas........................................125
5.4.2. Concentración de hidroxitirosol en plasma y las distintas fracciones de
lipoproteínas.......................................................................................................128

5.5. Estudio del efecto del hidroxitirosol sobre la expresión génica en ratones.......132
5.5.1. Evolución del peso corporal y examen macroscópico.............................132
5.5.2. Efecto del hidroxitirosol en la expresión génica en hígado de ratón.......132

6. DISCUSIÓN.................................................................................................................137

6.1. Efectos del hidroxitirosol sobre el desarrollo de la aterosclerosis.....................139
6.2. Absorción del hidroxitirosol en animales y humanos.........................................144
6.3. Asociación del hidroxitirosol a la LDL in vivo.....................................................150
6.4. Efectos del hidroxitirosol sobre la expresión génica en hígado de ratón..........153

7. CONCLUSIONES........................................................................................................157

8. BIBLIOGRAFIA...........................................................................................................163
III
ABREVIATURAS

ABTS Ácido 2,2’-Azino-bis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonico)
ABTS(cid:1)+ Radical del ácido 2,2’-Azino-bis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonico)
ADN Ácido desoxirribonucleico
AGMI Ácidos grasos mono-insaturados
AGPI Ácidos grasos poli-insaturados
AGS Ácidos grasos saturados
ARN Ácido ribonucleico
AUC Área bajo la curva
BSTFA N,O-Bis(trimetil-silil)-trifluoroacetamida
CAO Capacidad antioxidante
CG-EM Cromatografía de gases-espectrometría de masas
Cmax Concentración plasmática máxima
CML Células de músculo liso
COMT Catecol orto metil transferasa
CT Colesterol total
DHPA Ácido dihidroxifenilacético
ECV Enfermedad cardiovascular
EDTA Etilendiaminotetracético
EEM Error estándar de la media
HDL Lipoproteínas de densidad alta
HDL-C Colesterol HDL
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución
HT Hidroxitirosol
HvAc Ácido homovanílico
HvOH Alcohol homovanílico
Ke Constante de eliminación
LDL Lipoproteínas de densidad baja
IV