Estudio a nivel de moléculas individuales de la actividad de replicación del ADN de la polimerasa

117 Pages·2013·7.52 MB·Spanish

-Tesis Doctoral-
Estudio a nivel de molØculas individuales de la
actividad de replicaci(cid:243)n del ADN de la
polimerasa del bacteri(cid:243)fago Phi29
JosØ Alberto Morin Lantero
Julio de 2013
Universidad Aut(cid:243)noma de Madrid
Facultad de Ciencias
Departamento de F(cid:237)sica de la Materia Condensada

Memoria presentada para obtar al grado de Doctor en Biof(cid:237)sica
JosØ Alberto Morin Lantero
Junio, 2013
Universidad Aut(cid:243)noma de Madrid
Facultad de Ciencias
Departamento de F(cid:237)sica de la Materia Condensada
Directores de tesis:
Dr. Borja Ibarra
IMDEA Nanociencia
Dr. JosØ L. Carrascosa
CNB - CSIC
3

Abstract
The accurate replication of DNA is essential to keep genetic integrity. Replicative DNA polymerases
are the enzymes responsible for DNA synthesis; they work as molecular motors that translocates
alongDNAthroughaseriesofconformationalchangesfuelledbydNTP bindingandhydrolysis. This
process requires overcoming the energetic barrier associated with the base pair melting of its double
helix and a (cid:28)ne tuned coordination between the processes of DNA unwinding and replication. One
intriguing question that remains poorly understood is the exact mechanism of the coupling of these
two reactions. Moreover, little is known about the mechanochemistry of translocation: How thermal
and chemical energies are converted to movement? Or more speci(cid:28)cally, which step of the dNTP
binding and incorporation cycle lead to translocation? In the bacteriophage Phi29 the processes of
replication and unwinding are tightly coupled within the same protein: the Phi29 DNA polymerase.
Thispolymerasealsopresentsthebasicarchitectureofthepolymerasedomain,commontoallknown
polymerases, and the basic features of Family B DNA polymerases.
In this thesis we use optical tweezers to characterize, at a single molecule level, the basis for the
tight coupling between replication and unwinding and the mechanochemistry of translocation in
the Phi29 DNA polymerase. We found, after including the pause kinetic in a model to quantify
the unwinding mechanism, that the wild type and an unwinding de(cid:28)cient polymerase variant both
destabilize the fork with the same active mechanism: the polymerase destabilize at least two base
pairs in the junction with an energy per base pair of (cid:52)G = 2 k T.
d B
We also found that this polymerase presents a robust mechanism, capable of processing DNA at
high opposing forces. For all conditions tested (opposing and aiding forces (−50 to 20 pN)) the
velocity without pauses follows a Michaelis-Menten relation (for dNTP concentrations of 5, 10, 50,
100, 200, 500 µM). The force dependence of the Michaelis-Menten parameters (V and Km)
max
indicates that the force dependent step in the polymerization cycle is related to the binding step,
suggesting a Brownian ratchet type of mechanism.
5

˝ndice general
Abstract 5
1. Introducci(cid:243)n 5
1.1. La Replicaci(cid:243)n del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.1. El ciclo de Polimerizaci(cid:243)n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2. Mecanoqu(cid:237)mica de la translocaci(cid:243)n. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3. Estudios a nivel de molØculas indviduales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3.1. TØcnicas experimentales de molØcula individual . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.3.2. Aplicaciones al estudio de la replicaci(cid:243)n del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.4. La polimerasa de ADN de Phi29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2. Objetivos 29
3. Materiales y MØtodos 31
3.1. El instrumento de pinzas (cid:243)pticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1.1. Diseæo de la celda de (cid:29)uidos y sistema de (cid:29)uidos. . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.2. Diseæo de las molØculas de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.2.1. Estudio del acoplamiento de las actividades de extensi(cid:243)n del primer y despla-
zamiento de banda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.2.2. Estudio del mecanismo de translocaci(cid:243)n. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.2.3. Preparaci(cid:243)n de las asas con digoxigeninas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3. Protocolo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3.1. Protocolo para unir las molØculas de ADN entre las microesferas. . . . . . . . 38
3.3.2. Tampones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.3.3. Obtenci(cid:243)n de las microesferas recubiertas con antidigoxigenina. . . . . . . . . 39
3.4. Polimerasa de ADN de Phi29 salvaje, mutante D12AD66A y biotinilada. . . . . . . . 39
i
3.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia de la horquilla. . . . . . . . . 40
4. Resultados 41
4.1. Acoplamiento entre polimerizaci(cid:243)n y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . 41
4.1.1. Diseæo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.1.2. Caracterizaci(cid:243)n de la horquilla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.1.3. Detecci(cid:243)n de Actividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.1.4. Efecto de la estabilidad de la horquilla en la velocidad de replicaci(cid:243)n . . . . . 47
4.1.5. CinØtica de Pausas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.1.6. Cuanti(cid:28)caci(cid:243)n del mecanismo de apertura de la doble hebra.. . . . . . . . . . 58
4.2. Mecanoqu(cid:237)mica de la translocaci(cid:243)n. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.2.1. Diseæo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.2.2. Detecci(cid:243)n de Actividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.2.3. Efecto de la fuerza y la concentraci(cid:243)n de nucle(cid:243)tidos en la actividad de repli-
caci(cid:243)n. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
5. Discusi(cid:243)n 77
5.1. Acoplamiento entre polimerizaci(cid:243)n y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . 77
5.2. Mecanoqu(cid:237)mica de la translocaci(cid:243)n. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
6. Conclusiones 85
Agradecimientos 87
7. Anexos 89
7.1. Ensayo bioqu(cid:237)mico de actividad de polimerizaci(cid:243)n, exonucle(cid:243)lisis y desplazamiento de
banda de la polimerasa de Phi29 etiquetada con biotina en el extremo amino-termial. 90
7.1.1. Ensayo acoplado de polimerizaci(cid:243)n/exonucle(cid:243)lisis (pol/exo). . . . . . . . . . . 90
7.1.2. Ensayo de desplazamiento de banda acoplado a la replicaci(cid:243)n del ADN M13.. 91
7.2. Determinaci(cid:243)n de las energ(cid:237)as de enlace entre pares de bases AT y GC. . . . . . . . . 91
7.3. Modelo de Betterton y Julicher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
7.4. Art(cid:237)culos publicados durante el periodo de tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Bibliograf(cid:237)a 99
Nomenclatura 109
ii
˝ndice de (cid:28)guras
1.1. Prote(cid:237)nas que componen la horquilla de replicaci(cid:243)n. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2. El ciclo de polimerizaci(cid:243)n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3. Transici(cid:243)n de la con(cid:28)guraci(cid:243)n abierta a cerrada en el dominio dedos de la polimerasa Klentaq1. . . 10
1.4. Diagrama de energ(cid:237)a libre de una reacci(cid:243)n afectada por una fuerza inhibitoria. . . . . . . . . . . 12
1.5. Elasticidad del ADN de cadena doble y sencilla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.6. Ejemplo de aplicaciones de las tØcnicas de manipulaci(cid:243)n de molØculas individuales al estudio de
polimerasas de ADN, ARN y helicasas a nivel de molØculas individuales. . . . . . . . . . . . . . 21
1.7. Estructura del complejo binario de la polimerasa de Phi29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.1. Construcci(cid:243)n de la celda de (cid:29)uidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.2. Representaci(cid:243)nesquemÆtica(noaescala)delahorquillaconstruidaparaelestudiodelareplicaci(cid:243)n
acoplada al desplazamiento de banda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3. Representaci(cid:243)n esquemÆtica del diseæo y componentes de las molØculas de ADN utilizadas para
formar el complejo ADNp-ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.1. Diseæo experimental. Acoplamiento entre polimerizaci(cid:243)n y desplazamiento de banda . . . . . . . . 42
4.2. Detecci(cid:243)n de las actividades de desplazamiento de banda y extensi(cid:243)n del primer. . . . . . . . . . 43
4.3. Determinaci(cid:243)n de la curva de fuerza-extensi(cid:243)n del ssDNA para el estudio de la replicaci(cid:243)n acoplada
al desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.4. Dependencia con la tensi(cid:243)n de las velocidades medias para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. . 48
4.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. 49
4.6. Procedimiento de detecci(cid:243)n de pausas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.7. Procesividad de las polimerasas salvaje y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.8. Dependenciadeladuraci(cid:243)ndepausasconlaconcentraci(cid:243)ndepolimerasaparalaspolimerasassalvaje
y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
1
4.9. Comportamiento de la frecuencia de pausas para la polimerasa salvaje. Estudio del acoplamiento
entre las actividades de desplazamiento de banda y replicaci(cid:243)n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
4.10.Comportamientodelafrecuenciadepausasparaelmutanteddb. Estudiodelacoplamientoentrelas
actividades de desplazamiento de banda y replicaci(cid:243)n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4.11.Duraci(cid:243)n de pausas para las polimerasas salvaje y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.12.Representaci(cid:243)nesquemÆticaynotaci(cid:243)ndelmodeloutilizadoparadescribirelavancedelapolimerasa
en las condiciones de desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.13.Predicci(cid:243)n de la velocidad media de desplazamiento de banda con valores alternativos de ∆Gd y M. 64
4.14.Diseæo experimental. Estudio del mecanismo de translocaci(cid:243)n. Con(cid:28)guraci(cid:243)n fuerza a favor. . . . . 68
4.15.Diseæo experimental. Estudio del mecanismo de translocaci(cid:243)n. Con(cid:28)guraci(cid:243)n fuerza en contra. . . . 69
4.16.Actividad de replicaci(cid:243)n de la polimerasa inmovilizada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.17.Determinaci(cid:243)n de la curva de fuerza-extensi(cid:243)n del ssDNA. Mecanismo de translocaci(cid:243)n. . . . . . . 70
4.18.Procedimiento de detecci(cid:243)n de pausas. Mecanismo de translocaci(cid:243)n . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.19.Frecuencia y duraci(cid:243)n de pausas. Mecanismo de translocaci(cid:243)n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.20.Dependencia de la velocidad de replicaci(cid:243)n con la fuerza a diferentes concentraciones de dNTP en
los modods de extensi(cid:243)n del primer y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.21.Dependencia de la velocidad sin pausas con la concentraci(cid:243)n de nucle(cid:243)tidos . . . . . . . . . . . . 75
4.22.Dependencia de de Km, Vmax y Kb con la fuerza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
5.1. Mecanismo de apertura del ADN propuesto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
5.2. Efecto de la fuerza en la estabilidad del complejo binario/terciario . . . . . . . . . . . . . . . . 82
7.1. Ensayo acoplado de polimerizaci(cid:243)n/exonucle(cid:243)lisis (pol/exo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
7.2. esplazamiento de banda acoplado a la replicaci(cid:243)n del ADN M13 . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
7.3. Determinaci(cid:243)n de las energ(cid:237)as de enlace entre pares de bases AT y GC. . . . . . . . . . . . . . 93
7.4. Alineamiento de las curvas experimentales de apertura mecÆnica de la doble hebra. . . . . . . . . 95
2