Entwicklung analytisch-molekularbiologischer Verfahren zur Konstruktion einer Plasmid-Genbank

212 Pages·2005·4.67 MB·German

by  Unknown User

Entwicklung analytisch-molekularbiologischer Verfahren zur Konstruktion
einer Plasmid-Genbank aus Boden-DNA in Escherichia coli und
deren Durchmusterung nach neuen Enzymen für die technische Anwendung

Von der Fakultät Chemie der Universität Stuttgart
zur Erlangung der Würde eines Doktors
der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Abhandlung

Vorgelegt von
Hubert Zipper
aus Gleiwitz (Polen)

Hauptberichter: Prof. Dr. H. Brunner
Mitberichter: Prof. Dr. R. D. Schmid
Vorsitzender: Prof. Dr. D. H. Wolf
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2004

Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik der Universität Stuttgart
2004

Meinen Eltern
Maria und Richard Zipper

Hiermit erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine andere als die darin
angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik der Universität
Stuttgart angefertigt.
Mein besonderer Dank gilt Herren Prof. Dr. H. Brunner und Prof. Dr. R. D. Schmid für die
Überlassung des interessanten und vielseitigen Themas und großzügige Unterstützung, ihre
motivierende Betreuung sowie ihre stete Diskussionsbereitschaft während der Arbeit.
Herrn Prof. Dr. J. Bernhagen danke ich für die freundschaftliche Aufnahme und die hervor-
ragenden Arbeitsbedingungen in seiner Abteilung Molekulare Biotechnologie.
Frau Dr. Ch. Buta und Herrn Dr. F. Vitzthum bin ich für ihre stets intensive und anregende
Betreuung zutiefst zu Dank verpflichtet. Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Kollegin
K. Lämmle für die stets freundschaftliche, kollegiale und äußerst effektive Zusammenarbeit.
Den Projektpartnern BASF (Ludwigshafen), dem BMBF und der Peter und Traudl Engelhorn-
Stiftung danke ich für die Finanzierung. Insbesondere möchte ich Herrn Prof. Dr. B. Hauer und
Dr. M. Breuer (BASF) für ihre fachliche Diskussionsbereitschaft hervorheben. Mein Dank gilt
auch ihren Mitarbeitern, die eine schnelle Sequenzierung der Plasmide sowie die biochemische
Charakterisierung der lipolytisch aktiven Klone ermöglicht haben. Herrn Dr. Haberhauer (BASF)
möchte ich für die Durchführung der PEDANT-Analysen danken.
Des Weiteren bedanke ich mich bei allen meinen Kolleginnen und Kollegen des Instituts für
Grenzflächenverfahrenstechnik und des Instituts für Technische Biochemie der Universität
Stuttgart sowie des Fraunhofer-Instituts für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik. Im
Besonderen danke ich B. Striegel, G. Zelt und Dipl. Ing. (FH) G. Geiger für ihre Hilfsbereitschaft
im Labor. Herrn Dr. M. Baumann möchte ich für seine stets freundschaftliche Zusammenarbeit
und wertvollen Hinweise danken. Frau G. Beck-Schwadorf danke ich für die Aufnahme der MS-
Spektren und für die ionenchromatographischen Analysen.
Herrn Dr. J. Altenbuchner vom Institut für Industrielle Genetik der Universität Stuttgart danke
ich für die Überlassung des Plasmids pJOE930. Der Messabteilung des Instituts für Angewandte
Makromolekulare Chemie der Universität Stuttgart danke ich für die Aufnahme der NMR-
Spektren. Herrn Dr. J. Opitz vom Institut für Organische Chemie möchte ich für die
Feinmassenbestimmung von SYBR Green I mittels FAB-MS danken. Prof. Dr. F. Brümmer
(Universität Stuttgart), Dr. M. Schirmer (Universität Bremen) und Dr. H.-U. Steeger
(Westfälische Wilhelms-Universität Münster) danke ich herzlich für die Bereitstellung der
Boden- bzw. Sedimentproben.
Inhaltsverzeichnis VII
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis..............................................................................................................................XII
Abbildungsverzeichnis..............................................................................................................................XIII
Tabellenverzeichnis....................................................................................................................................XV
ABSTRACT............................................................................................................................................XVI
ZUSAMMENFASSUNG....................................................................................................................XXVII
1 ALLGEMEINER TEIL.....................................................................................................................1
1.1 Biokatalyse in der chemischen Industrie........................................................................................1
1.2 Identifizierung neuer Enzyme........................................................................................................4
1.3 Aufschluss von Bodenmikroorganismen mit überkritischem Kohlendioxid zur DNA-Isolierung 7
1.4 Struktur und Eigenschaften von Huminstoffen..............................................................................9
1.5 Reinigung von Umwelt-DNA-Rohextrakten...............................................................................11
1.6 Einsatz von DNA-Fluoreszenzfarbstoffen in analytisch-molekularbiologischen Verfahren.......13
2 ZIELSETZUNG................................................................................................................................15
3 ERGEBNISSE TEIL I: ANALYTIK.............................................................................................17
3.1 Untersuchungen zur Interaktion zwischen SYBR Green I und dsDNA......................................17
3.1.1 Struktur und Eigenschaften von SYBR Green I..........................................................................17
3.1.1.1 Strukturanalyse von SYBR Green I und PicoGreen....................................................................17
3.1.1.2 Konzentration und spektroskopische Eigenschaften von SYBR Green I....................................19
3.1.2 Interaktion von SYBR Green I mit dsDNA.................................................................................20
3.1.2.1 Spektroskopische Eigenschaften von an dsDNA gebundenem SYBR Green I...........................20
3.1.2.2 SYBR Green I/dsDNA-Fluoreszenz und das Farbstoff/bp-Verhältnis........................................22
3.1.2.3 Spektrale Änderungen der SYBR Green I/dsDNA-Komplexe und das Farbstoff/bp-Verhältnis 23
3.1.2.4 Hydrodynamische Eigenschaften von SYBR Green I/dsDNA-Lösungen...................................24
3.1.2.5 Elektrophoretische Mobilität der SYBR Green I/dsDNA-Komplexe..........................................26
3.1.2.6 Interaktion von SYBR Green I mit dA•dT- und dG•dC-Homopolymeren..................................27
3.1.3 Interaktion von SYBR Green I mit ssDNA..................................................................................30
3.1.3.1 Aufnahme von Reassoziationskurven mit SYBR Green I...........................................................32
3.2 Einfluss von Huminsäuren auf die Quantifizierung von DNA mittels SYBR-Green-I-Fluoreszenz
und Konsequenzen für die Analyse von Boden- und Sedimentproben........................................35
3.2.1 Absorptionsspektren von Huminsäuren.......................................................................................35
VIII Inhaltsverzeichnis
3.2.2 Einfluss von Huminsäuren auf die spektralen Eigenschaften von SYBR Green I und der
SYBR Green I/DNA-Komplexe..................................................................................................36
3.2.2.1 Differenzspektren.........................................................................................................................36
3.2.2.2 Fluoreszenzspektren.....................................................................................................................38
3.2.3 Löschung der Farbstoff/DNA-Fluoreszenz durch Huminsäuren.................................................40
3.2.3.1 Innerer Filtereffekt.......................................................................................................................42
3.2.3.2 Dynamische und statische Fluoreszenz-Löschung.......................................................................43
3.2.4 Interaktion der Huminsäuren mit DNA, SYBR Green I und dem Komplex...............................47
3.2.4.1 Differenzspektroskopie................................................................................................................47
3.2.4.2 Gel-Retardationsanalyse..............................................................................................................48
3.2.4.3 Kompetitionsexperimente............................................................................................................50
3.2.5 Einfluss der SYBR-Green-I-Konzentration.................................................................................51
3.2.6 DNA-Quantifizierung in Umwelt-Rohextrakten mittels SYBR-Green-I-Fluoreszenz................53
4 ERGEBNISSE TEIL II: KONSTRUKTION EINER PLASMID-GENBANK AUS BODEN-
DNA....................................................................................................................................................57
4.1 Strategie zur Konstruktion einer Plasmid-Genbank aus Boden-DNA.........................................57
4.2 Konstruktion einer Plasmid-Genbank durch Klonierung von Boden-DNA in E. coli.................61
4.2.1 Entnahme der Bodenprobe...........................................................................................................61
4.2.2 Aufschluss von Bodenmikroorganismen.....................................................................................61
4.2.2.1 Aufschluss durch schnelle Dekompression von überkritischem Kohlendioxid...........................61
4.2.2.2 Aufschluss nach Zhou et al..........................................................................................................63
4.2.3 Reinigung der Boden-DNA-Rohextrakte.....................................................................................64
4.2.4 Restriktionsspaltung huminsäurehaltiger Boden-DNA-Lösungen...............................................66
4.2.5 Präparation der Insert-DNA.........................................................................................................69
4.2.6 Präparation des Plasmids pJOE930..............................................................................................69
4.2.7 Ligation und Transformation in E. coli DH5α............................................................................70
4.2.8 Vereinzelung und Ablage der rekombinanten Transformanden..................................................70
4.2.9 Überprüfung und Sequenzierung von aktiven Klonen.................................................................71
4.2.10 Analyse der Sequenzdaten und biochemische Charakterisierung der aktiven Klone..................71
4.3 Charakterisierung der Plasmid-Genbank.....................................................................................72
5 ERGEBNIS TEIL III: DURCHMUSTERUNG DER PLASMID-GENBANK NACH
ENZYMEN FÜR DIE INDUSTRIELLE BIOKATALYSE.........................................................76
5.1 Durchmusterung der Plasmid-Genbank nach Hydrolasen...........................................................76
Inhaltsverzeichnis IX
5.1.1 Durchmusterung auf die Fähigkeit zur Hydrolyse von Tributyrin...............................................76
5.1.1.1 Bioinformatische Analyse der Plasmide aktiver Klone...............................................................78
5.1.1.2 Substratspezifität einiger Klone mit lipolytischer Aktivität.........................................................85
5.1.2 Durchmusterung der Plasmid-Genbank nach Amylasen.............................................................89
5.1.3 Durchmusterung der Plasmid-Genbank nach Proteasen..............................................................90
5.1.4 Durchmusterung der Plasmid-Genbank nach Phosphatasen/Phytasen........................................92
5.2 Durchmusterung der Plasmid-Genbank nach Alkohol-Oxidoreduktasen....................................95
5.2.1 Identifizierung von Oxidoreduktasen mit Hilfe von Aktivitäts-basierten Tests..........................96
5.2.2 Identifizierung von Oxidoreduktasen durch Sequenzvergleich.................................................102
5.3 Zufällig identifizierte Enzymaktivitäten....................................................................................103
5.4 Übersicht über die gefundenen Klone........................................................................................106
6 DISKUSSION..................................................................................................................................112
6.1 Analytik......................................................................................................................................112
6.1.1 Interaktion von SYBR Green I mit dsDNA...............................................................................112
6.1.2 Quantifizierung von DNA in Rohextrakten aus Boden- und Sedimentproben..........................121
6.2 Konstruktion einer Plasmid-Genbank aus Boden-DNA............................................................129
6.2.1 Aufschluss von Bodenbakterien.................................................................................................129
6.2.2 Reinigung und Restriktionsspaltung von genomischer Boden-DNA........................................129
6.2.3 Klonierung der Boden-DNA und Durchmusterung der Genbank..............................................132
6.3 Gefundene Enzyme....................................................................................................................136
6.4 Ausblick.....................................................................................................................................143
7 MATERIAL....................................................................................................................................144
7.1 Geräte.........................................................................................................................................144
7.2 Verbrauchsmaterialien...............................................................................................................145
7.3 Chemikalien...............................................................................................................................145
7.4 Biochemikalien..........................................................................................................................146
7.5 Puffer und Lösungen..................................................................................................................146
7.6 Medien.......................................................................................................................................148
7.7 Antibiotika und Medienzusätze.................................................................................................149
7.8 Bakterienstämme........................................................................................................................150
7.9 Plasmide.....................................................................................................................................150
7.10 Software.....................................................................................................................................150
X Inhaltsverzeichnis
8 METHODEN...................................................................................................................................151
8.1 Spektroskopische und chromatographische Methoden..............................................................151
8.1.1 Kernresonanzspektroskopie.......................................................................................................151
8.1.2 Absorptionsspektroskopie..........................................................................................................151
8.1.2.1 Bestimmung von UV/Vis-Spektren...........................................................................................151
8.1.2.2 Spektrophotometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren in Lösung....................................151
8.1.2.3 Spektrophotometrische Bestimmung von Proteinen nach Bradford..........................................152
8.1.3 Fluoreszenzspektroskopie..........................................................................................................152
8.1.3.1 DNA-Quantifizierung in Lösung mittels SYBR Green I...........................................................153
8.1.3.2 DNA-Quantifizierung in Umwelt-DNA-Rohextrakten mittels SYBR Green I.........................153
8.1.3.3 Aufnahme von Reassoziationskurven mit SYBR Green I.........................................................155
8.1.4 Differenzspektroskopie..............................................................................................................155
8.1.5 Ionenchromatographie...............................................................................................................156
8.2 Physikalisch-chemische und andere Methoden.........................................................................156
8.2.1 Massenspektrometrie.................................................................................................................156
8.2.2 Viskosimetrie.............................................................................................................................156
8.2.3 Statistische Auswertung.............................................................................................................157
8.3 Mikrobiologische und molekulargenetische Methoden.............................................................157
8.3.1 Stammhaltung und Kultivierung von Bakterien........................................................................157
8.3.1.1 Stammhaltung und Kultivierung von Einzelkulturen................................................................157
8.3.1.2 Stammhaltung und Kultivierung in Mikrotiterplatten................................................................157
8.3.2 Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA aus E. coli..........................................................158
8.3.2.1 Schnellisolierung von Plasmid-DNA.........................................................................................158
8.3.2.2 Isolierung reiner Plasmid-DNA mit Silikagel-Säulen................................................................158
8.3.3 Isolierung von DNA aus Bodenproben......................................................................................158
8.3.3.1 DNA-Isolierung durch schnelle Dekompression von überkritischem Kohlendioxid................158
8.3.3.2 Methode zur DNA-Isolierung nach Zhou et al..........................................................................159
8.3.3.3 DNA-Isolierung nach Moré et al...............................................................................................160
8.3.4 Isolierung von DNA aus Reinkulturen.......................................................................................160
8.3.5 Reinigung von DNA-Lösungen.................................................................................................160
8.3.5.1 Präzipitation von DNA mit Ethanol bzw. Isopropanol..............................................................160
8.3.5.2 Phenol/Chloroform- bzw. Chloroform-Extraktion von DNA-Lösungen...................................160