Die Applikationsfelder optrodengestützter Live-Cell

306 Pages·2014·15.26 MB·English

by  Björn Sommerfeldt

FRIEDRICH-ALEXANDER
UNIVERSITÄT
ERLANGEN-NÜRNBERG

TECHNISCHE FAKULTÄT

Die Applikationsfelder optrodengestützter Live‐Cell‐
Mikroskopie als HCS‐Plattform im Zellkulturlabor 

Der Technischen Fakultät 
der Friedrich‐Alexander‐Universität 
Erlangen‐Nürnberg 
zur 
Erlangung des Doktorgrades 
Dr.‐Ing. 

vorgelegt von 
Dipl.‐Ing. Björn Sommerfeldt 
aus  
Erlangen
Als Dissertation genehmigt 
Von der Technischen Fakultät 
der Friedrich‐Alexander‐Universität Erlangen‐Nürnberg 

Tag der mündlichen Prüfung: 29.9.2014 
Vorsitzende/r des Promotionsorgans: Prof. Dr.‐Ing. habil. M. Merklein 
Gutachter/in: Prof. Dr. rer. nat. Rainer Buchholz 
  Prof. Dr. rer. nat. Andreas Wierschem
„Akzeptiere, was du nicht tun kannst, weil es so vieles gibt, was du
stattdessen machen kannst“
Sam Berns (*1996 ‐ 2014)
Danksagung 
Diese  Dissertation  resultiert  aus  meinen  Forschungstätigkeiten  am  Lehrstuhl  für 
Bioverfahrenstechnik  der  Universität  Erlangen‐Nürnberg  unter  der  Leitung  von  Professor  Rainer 
Buchholz.  Ich  möchte  Herrn  Professor  Buchholz  an  dieser  Stelle  für  die  Möglichkeit  und 
Bereitstellung  des  Themas  danken.  Der  stetigen  Diskussionsbereitschaft  und  dem  Interesse  an 
meinen Forschungsergebnissen gilt dieser Dank im Besonderen.  
Herrn  Professor  Andreas  Wierschem,  Herrn  Professor  Joachim  Hornegger  und  Herrn  Professor 
Antonio Delgado danke  ich  für die Übernahme des Koreferats, des  fachfremden Prüfers  sowie des 
Prüfungsvorsitzes und, dass sie somit der wissenschaftlichen Aussprache beiwohnten.  
Insbesondere möchte  ich mich  bei  den  Partnern  und  Bearbeitern  des  Projekts  „COSIR“  bedanken, 
durch  welche  drei  interessante  Jahre  der  Zusammenarbeit  gestaltet  worden  sind.  Diese  sind 
Professor  Joachim  Hornegger  (LME),  Firas  Muallah  (LME),  Walter  Greul  (AstrumIT),  Simon  Schöll 
(AstrumIT  &LME),  Dr.  Gernot  John  (PreSens),  Dr.  Sarina  Arain  (PreSens)  sowie  Christoph  Saller 
(PreSens). 
Der Firma Memmert aus Schwabach danke  ich  für die stets sehr gut klimatisierte Unterstützung  in 
Form eines Inkubators.  
Dr.  Anna  Becker  danke  ich  im  Besonderen  für  die  aufbauenden Gespräche  und  das  immer  offene 
Ohr.  Tobias  Weidner  danke  ich  für  die  vielen  Jahre,  in  denen  wir  zwar  Unterschiedliches 
bearbeiteten,  aber  oft  das  gleiche  erlebten  und  die  gleichen  Schlüsse  zogen.  Danke  Euch  für  die 
letzten Jahre! 
Ein besonderer Dank geht an meine Kollegen Ricarda Friebe, Juliane Richter, Josef Taucher, Ibrahim 
Ahmed, Matthias Stach, Stephan Popov, Stefan Ringgeler, Konstantin Präbst, Matthias Schirmer und 
Anette Amtmann für die vielen Gespräche und Anregungen.  
Ein  ebenso  herzlicher  Dank  geht  an  meine  Diplom‐,  Bachelor‐  und  Masterarbeiter  sowie 
studentischen  Hilfskräfte,  die  mir  mit  ihrem  Interesse  und  Engagement  einen  großen  Beitrag 
geleistet  haben:  Hannes  Engelhardt,  Konstantin  Präbst,  Fiona  Rupprecht,  Sophie  Bindl,  Bertram 
Geinitz, Frank Piepenbreier, Marina Zwack, Julia Zieringer, Josef Taucher und Christian Lesko.  
Der  größte  Dank  gilt  sicherlich  meiner  Familie  und  Freundin,  die  mich  immer  unterstützt  haben. 
Dadurch  sind mir  viele  Steine  aus  dem Weg  geräumt worden, wodurch  ich mich  auf  diese  Arbeit 
fokussieren konnte. Danke für Alles!
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS  

Inhaltsverzeichnis ..................................................................................................................................... I 
Abkürzungen ........................................................................................................................................... V 
Zusammenfassung .................................................................................................................................. IX 
1.  Einleitung ......................................................................................................................................... 1 
2.  Stand des Wissens ........................................................................................................................... 2 
2.1.  Metabolismus der eukaryotischen Zelle ................................................................................. 2 
2.1.1.  Glykolyse.......................................................................................................................... 3 
2.1.2.  Citratzyklus ...................................................................................................................... 8 
2.1.3.  Atmungskette ................................................................................................................ 10 
2.1.4.  Regeneration von zytosolischem NADH ........................................................................ 13 
2.1.5.  Antioxidantien ............................................................................................................... 14 
2.1.6.  Hypoxie .......................................................................................................................... 16 
2.1.7.  Zellteilung ...................................................................................................................... 19 
2.1.8.  Zytoskelett ..................................................................................................................... 21 
2.1.9.  Zelltod ............................................................................................................................ 21 
2.1.10.  Der Warburg‐Effekt ....................................................................................................... 25 
2.1.11.  Metabolischer Phänotyp von Krebszellen ..................................................................... 25 
2.2.  Analytik .................................................................................................................................. 26 
2.2.1.  Molekulare Analytik ...................................................................................................... 27 
2.2.2.  Instrumentelle Analytik ................................................................................................. 32 
2.3.  Modeltoxine .......................................................................................................................... 36 
2.3.1.  Ionomycin ...................................................................................................................... 37 
2.3.2.  Kupfer ............................................................................................................................ 37 
2.3.3.  Kobalt ............................................................................................................................ 37 
2.3.4.  Inhibition der Atmungskette ......................................................................................... 37 
3.  Zielsetzung ..................................................................................................................................... 40 
4.  Material und Methoden ................................................................................................................ 41 
4.1.  Allgemeine Methoden Zellkultivierung ................................................................................. 41 
4.1.1.  Verwendete Medienvarianten ...................................................................................... 41 
4.1.2.  Stammhaltung ............................................................................................................... 42 
4.2.  Spezielle Methoden Zellkultivierung ..................................................................................... 42 
4.2.1.  Trypanblauzählung ........................................................................................................ 42 
4.2.2.  SDR‐Messungen ............................................................................................................. 43 
4.2.3.  WST‐8 Proliferationsassay ............................................................................................. 43 
‐Seite I‐
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.4.  Zytotoxizitäts‐Tests ........................................................................................................ 43 
4.2.5.  Durchflusszytometrie .................................................................................................... 44 
4.2.6.  Fluoreszenzmikroskopie ................................................................................................ 45 
4.2.7.  Wachstumskurven ......................................................................................................... 45 
4.2.8.  ATP‐Bestimmung ........................................................................................................... 49 
4.3.  Parametrisierung von Bilddaten ............................................................................................ 49 
4.3.1.  Bildergenerierung .......................................................................................................... 49 
4.3.2.  Bildauswertung .............................................................................................................. 49 
4.4.  Spezielle Methoden der Bioanalytik ...................................................................................... 55 
4.4.1.  Standards ....................................................................................................................... 56 
4.4.2.  Probenvorbereitung ...................................................................................................... 56 
4.4.3.  HPLC Methode ............................................................................................................... 57 
4.4.4.  MS Methode .................................................................................................................. 57 
4.5.  Berechnung abgeleiteter Größen .......................................................................................... 58 
4.5.1.  Parameter aus Rohdaten ............................................................................................... 58 
4.5.2.  Berechnung der Sauerstoffaufnahmerate .................................................................... 59 
4.5.3.  Berechnung von CORE‐Parametern .............................................................................. 59 
4.5.4.  Berechnung der zellbezogenen WST‐Bildung ............................................................... 60 
5.  Ergebnisse ..................................................................................................................................... 61 
5.1.  Der Sensor Dish Reader (SDR) ............................................................................................... 61 
5.1.1.  Kultivierung im SDR ....................................................................................................... 61 
5.1.2.  Bestimmung kla‐Wert für 24‐Multiwell Platten ............................................................ 65 
5.2.  Untersuchung des Metabolismus .......................................................................................... 66 
5.2.1.  Wachstumskurven‐bezogene Parameter ...................................................................... 66 
5.2.2.  Online‐Parameter des Metabolismus ........................................................................... 72 
5.2.3.  Offline‐Parameter des Metabolismus ........................................................................... 81 
5.3.  Beeinflussung des Metabolismus .......................................................................................... 91 
5.3.1.  Hemmung der Atmungskette ........................................................................................ 91 
5.3.2.  Induktion der ROS‐Bildung durch Kupfer .................................................................... 110 
5.3.3.  Induktion von Hypoxie ................................................................................................ 112 
5.3.4.  Störung der Calcium‐Homöostase durch Ionomycin .................................................. 114 
5.3.5.  Induktion von Stoffwechselwegen .............................................................................. 117 
5.4.  Datenerhebung aus Mikroskop‐Bildern .............................................................................. 124 
5.4.1.  Fluoreszenzmarkiertes Imaging ................................................................................... 124 
5.4.2.  Parametrisierung ungefärbter Einzelbildaufnahmen .................................................. 127 
6.  Fehlerbetrachtung ....................................................................................................................... 139 
6.1.  Allgemeine Laborgeräte ...................................................................................................... 139 
6.2.  Zellkultur .............................................................................................................................. 139 
6.3.  Wirkstoff‐Tests .................................................................................................................... 140 
‐Seite II‐
INHALTSVERZEICHNIS
6.4.  Durchflusszytometrie .......................................................................................................... 140 
6.5.  Sensor Dish Reader .............................................................................................................. 140 
6.6.  Probenaufbereitung für LC‐MS ........................................................................................... 140 
6.7.  Detektion der Analyten mit der LC‐MS ............................................................................... 141 
7.  Diskussion .................................................................................................................................... 142 
7.1.  Vergleichbarkeit der Basis‐Systeme .................................................................................... 142 
7.1.1.  Verhalten von Zellen in SDR und originalen Greiner Platten ...................................... 142 
7.1.2.  Sensitivität der SDR‐Messung ..................................................................................... 144 
7.1.3.  Abgleich mit Literaturdaten ........................................................................................ 145 
7.2.  Ableitung metabolische Phänotypen .................................................................................. 145 
7.2.1.  Allgemeine Phänomene .............................................................................................. 145 
7.2.2.  Variation von Glutamin ............................................................................................... 146 
7.2.3.  Serumentzug und Suspensions‐Zwang ........................................................................ 148 
7.2.4.  ACD und pO2,min als Indikator der Nährstofflimitierung .............................................. 149 
7.2.5.  ACR als Maß der Laktat‐Anreicherung ........................................................................ 150 
7.2.6.  OUR als Maß für die OXPHOS ...................................................................................... 153 
7.2.7.  Implikationen der NADH‐Regeneration ...................................................................... 155 
7.2.8.  Glykolyse und Zellteilung ............................................................................................. 156 
7.2.9.  Der Stoffwechsel von Leberzellen ............................................................................... 158 
7.2.10.  Oxidativer Phänotyp ‐ „primäre Zellen“ ...................................................................... 160 
7.3.  Optische Ausprägung metabolischer Phänotypen .............................................................. 161 
7.3.1.  Auswertung der Standbilder ....................................................................................... 161 
7.3.2.  Beurteilung der mikroskopischen Färbungen ............................................................. 173 
7.4.  Beeinflussung des Metabolismus ........................................................................................ 174 
7.4.1.  Inhibierung der individuellen Komplexe der OXPHOS ................................................ 174 
7.4.2.  Bestimmung des Todesmechanismus ......................................................................... 179 
7.4.3.  Induktion von ROS durch Kupfer ................................................................................. 182 
7.4.4.  Kobalt‐abhängige Hypoxie ........................................................................................... 183 
7.4.5.  PCD‐abhängige Hypoxie .............................................................................................. 184 
7.4.6.  Störung der Calcium‐Homöostase ............................................................................... 186 
7.4.7.  C‐Quellen Variation und gehemmte OXPHOS ............................................................. 189 
7.4.8.  Hypoxie‐Indikatoren durch Hemmung mit Oligomycin .............................................. 191 
7.5.  Zusammenfassung ............................................................................................................... 192 
8.  Ausblick ....................................................................................................................................... 193 
9.  Verzeichnisse ............................................................................................................................... 194 
9.1.  Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................... 194 
9.2.  Tabellenverzeichnis ............................................................................................................. 199 
9.3.  Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 201 
9.4.  Betreute wissenschaftliche Arbeiten und Ergebnisse ......................................................... 212 
‐Seite III‐
INHALTSVERZEICHNIS
10.  Anhang..................................................................................................................................... 212 
10.1.  Geräte und Chemikalien .................................................................................................. 212 
10.2.  Wachstumskurven ........................................................................................................... 217 
10.3.  OUR Graphen ................................................................................................................... 263 
10.4.  ACR Graphen ................................................................................................................... 266 
10.5.  WST Graphen ................................................................................................................... 270 
10.6.  Glucose ............................................................................................................................ 276 
10.7.  Laktat ............................................................................................................................... 282 
10.8.  FACS Daten ...................................................................................................................... 285 

‐Seite IV‐
ABKÜRZUNGEN
ABKÜRZUNGEN  
2PG  2‐Phosphoglycerat 
3PG  3‐Phosphoglycerat 
7‐AAD  7‐Aminoactinomycin 
ACD  area cell density; Flächenzelldichte 
ACR  acidification rate; Ansäuerungsrate 
ADP  Adenosindiphosphat 
Akt  Protein Kinase B 
AMP  Adenosinmonophosphat 
AMPK  AMP‐aktivierte Proteinkinase 
Asc/AscH  Ascorbat/Ascorbinsäure 
atm  Atmosphärendruck 
ATP  Adenosintriphosphat 
Bcl‐2  B‐cell lymphoma 2 
BPG  Bisphosphoglycerat (1,3 und 2,3BPG) 
CA  Carboanhydrase 
CdK  Cyclin‐dependent kinase; Zyklinabhängige Kinase 
CHO  chinese hamster ovary 
CK  Creatin‐Kinase 
CoA  Coenzym A 
COSIR  Combination of Optical Sensors and Image Recognition  
Cr  Creatin 
CrP  Creatin‐Phosphat 
DDR  Discoidin domain receptor 
DHAP  Dihydroxyacetonphosphat 
DMEM  Dulbecco's Modified Eagle Medium 
DMSO  Dimethylsulfoxid 
DNA  Desoxyribonukleinsäure 
DNP  2,4‐Dinitrophenol 
ER  Endoplasmatisches Reticulum  
F1,6BP  Fructose‐1,6‐bisphosphat 
F2,6BP  Fructose‐2,6‐Bisphosphat 
F6P  Fructose‐6‐phosphat 
FIH  Factor Inhibiting HIF 
FKS  Fötales Kälberserum 
FMN  Flavinmononukleotid  
G3P, Glyc‐3P  Glycerin‐3‐phosphat 
G6P  Glucose‐6‐phosphat 
G6PD  Glucose‐6‐phosphat‐Dehydrogenase 
GDP  Guanosindiphosphat 
GIDH  Glutamatdehydrogenase 
Glc  Glucose 
Gln  Glutamin 
GLS  Glutaminase 
GLUT  Glucosetransporter 
GOT  Glutamat‐Oxalacetat‐Transaminase 
‐Seite V‐
ABKÜRZUNGEN
GPT  Glutamat‐Pyruvat‐Transaminase 
GSH  Glutathion, reduzierte Form 
GSSG  Glutathion, oxidierte Form 
GTP  Guanosintriphosphat 
GZZ  Gesamtzellzahl 
Ha  Hatta‐Modul 
HeLA  Henrietta Lacks, Zelllinie aus Epithelzellen eines Zervixkarzinoms 
HepG2  Hepatocellular carcinoma, Zelllinie 
HIF‐1  Hypoxie‐induzierter Faktor 
HMP‐Shunt  Hexose‐Monophosphat‐Shunt 
HX  Hypoxanthin 
IC  Inhibitorische Konzentration  
IDH  Isocitrat‐Dehydrogenase 
ILGF  Insulin‐like growth factor; insulinähnlicher Wachstumsfaktor 
kla  volumenbezogener Stoffübergangskoeffizient 
Lac  Laktat  
LC  Letale Konzentration  
LDH  Laktatdehydrogenase 
LZZ  Lebendzellzahl 
MCF‐7  Michigan Cancer Foundation ‐ 7, Zelllinie 
MCT  Monocarboxylat‐Transporter 
mPMS  1‐Methoxy Phenazinmethosulfat 
MPTP  Mitochondrial Permeability Transition Pore 
MTT  3‐(4,5‐Dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyltetrazoliumbromid 
+
NAD /NADH  Nicotinamidadenindinukleotid oxidierte/reduzierte Form 
+
NADP /NADPH  Nicotinamidadenindinukleotidphosphat oxiderte/reduzierte Form 
ODD  oxygen dependent domain 
OUR  oxygen uptake rate; Sauerstoffaufnahmerate 
OXPHOS  Oxidative Phosphorylierung; Atmungskette 
PCD  peak cell density; maximale Zelldichte in Wachstumskurve 
PDH  Pyruvatdehydrogenase 
PDK  Pyruvatdehydrogenase‐Kinase 
PEP  Phosphoenolpyruvat  
PFK1  Phosphofructokinase 1 
PGAM  Phosphoglyceratmutase 
PGK  Phosphoglyceratkinase 
PHD  Prolylhydroxylase‐Domain 
pHe  extrazellulärer pH‐Wert 
pHi  intrazellulärer pH‐Wert 
Pi  Phosphat‐Rest 
PI3K  Phosphoinositid‐3‐Kinase 
PJ  Propidiumjodid 
PK  Pyruvatkinase 
PMET  Plasma Membrane Electron Transport; Elektronen‐Transport über 
Plasmamembran 
PPP  Pentosephosphatweg 
PS  Phosphatidylserin 
‐Seite VI‐