Contribution à l'étude des virus géants à ADN.

161 Pages·2013·10.59 MB·French

by  Adrien Jeanniard

Aix-Marseille Université
THESE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR D'AIX-MARSEILLE UNIVERSITE
Spécialité : Bioinformatique et Génomique
Préparée au laboratoire Information Génomique & Structurale
Dans le cadre de l'Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé
A la redécouverte des Chlorovirus :
Contribution à l'étude des virus géants à ADN.
Présentée et soutenue publiquement par
Adrien Jeanniard
le 21 / 06 / 2013
Thèse dirigée par Jean-Michel Claverie (directeur)
et Guillaume Blanc (co-directeur et principal encadrant)
Jury
Pr. Christophe Robaglia Président du jury
Dr. Richard Cooke Rapporteur
Dr. Nigel Grimsley Rapporteur
Pr. Jean-Michel Claverie Examinateur
Dr. Guillaume Blanc Examinateur

Remerciements
Je voudrais tout d'abord exprimer mes plus profonds remerciements à mes deux directeurs
de thèse : Guillaume Blanc, pour m'avoir confié ce projet de thèse et pour m'avoir encadré
contre vents et marées. Ce sont ta constante disponibilité et ta patience à toute épreuve à mon
égard qui m'ont permis de mener à bien ma thèse ! Merci également pour les nombreux coups
de main / indications / instructions que tu a pu me donner tout au long de ces années. Jean-
Michel Claverie pour m'avoir fait confiance en m'acceptant par deux fois au sein de son
laboratoire : une première fois pour mon stage de Master puis une seconde fois pour y
effectuer mon doctorat. Votre culture scientifique et votre aptitude à rendre passionnant
n'importe quel projet m'épateront toujours !
Un grand merci à Pascal Hingamp qui par ses cours, sa pédagogie et son engagement
auprès de ses élèves m'aura littéralement fait découvrir le monde de la bioinformatique. C'est
en grande partie grâce à toi si j'en suis là aujourd'hui. J'ai également pris beaucoup de plaisir à
découvrir l'enseignement à tes côtés (et pour ce point particulier je remercie aussi Carl
Herrmann et Emmanuel Talla). J'espère que mes chtulhus continueront longtemps à dévorer
tes sapiens ! Merci à Sébastien Santini pour nos multiples discussions rolistico-vidéo-
ludiques et nos sandwichs du midi. Merci aussi à Defné Arslan et Yann Loe-Mie pour
m'avoir « montré la voie » en étant thésards avant moi. Gabriel Doutre, c'est toi le prochain !
Et à quand la ligue Grand Maître ? Merci aussi aux nombreuses « filles de l'open space » que
j'ai pu côtoyer au fil des ans : Virginie Seltzer, Laure Bellec, Aurélie Chambouvet, Julia
Bartoli et Nadège Philippe. Vous m'aurez fait découvrir le quotidien mouvementé des
expérimentalistes ! Merci aussi à Emilie Villard pour sa bonne humeur et ses conseils avisés
sur le format de ce manuscrit. Merci à Youri Timsit pour nos quelques discussions
métaphysiques et ton approche si philosophique de la science et de la vie en général. C'est
toujours rafraichissant de pouvoir discuter avec toi. Merci à Estelle Grossetête pour sa
gestion incroyable de tout ce qui est administratif même dans les pires situations. Je ne pense
pas revoir de si tôt une secrétaire aussi efficace ! Merci à tous les autres membres de l'IGS,
dont beaucoup avec qui je n'aurai définitivement pas passé assez de temps : Audrey
Lartigues, Chantal Abergel, Deborah Byrne, Dider Léandri, Hiroyuki Ogata, Jean-
Marie Alempic, Lionel Bertaux, Magali Lescot, Matthieu Legendre, Michael Mozar,
Olivier Poirot, Sandra Jeudy et Virginie Collomb.
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Merci également au professeur James L. Van Etten et à son équipe pour la disponibilité
de ces données biologiques, mais aussi pour l'enthousiasme et l'intérêt que vous avez porté à
mes travaux, ainsi que pour votre proposition de post-doc. Merci aussi à Christophe
Robaglia, Richard Cooke et Nigel Grimsley pour avoir accepté de faire partie de mon jury
de thèse, ainsi que pour avoir évalué l'ensemble de mon travail via ce manuscrit.
Un grand merci à mes amis de fac de toujours qui m'accompagnent depuis la &ère année
de licence : Cyrille Lepoivre, Duncan Berenguier et Nicolas Descotes. Mine de rien, ça fait
bientôt 9 ans qu'on s'est tous rencontré! Entre nos sudokus multi-CPU endiablés, la fabrication
de ma cotte de maille, notre trop bref groupe de musique et notre créativité minecraftienne, on
peut dire que ces années auront été bien remplies.
Enfin merci à toute ma famille pour m'avoir toujours soutenu et facilité la vie tout au long
de ma scolarité.
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Sommaire
Remerciements.....................................................................................................5
Avant-propos........................................................................................................9
Abréviations.......................................................................................................11
Introduction ......................................................................................................13
Des premiers pas de la virologie aux chlorovirus............................................................15
Les virus et l'histoire........................................................................................................15
Découverte des premiers virus.........................................................................................16
L'essor de la virologie......................................................................................................18
Définition moléculaire des virus......................................................................................18
Classification des virus....................................................................................................19
Les « Nucleo-Cytoplasmic Large dsDNA Viruses »........................................................21
Sept familles de virus géants...........................................................................................22
Les Phycodnaviridae..........................................................................................................26
Les phycodnavirus et leurs hôtes.....................................................................................26
Particularités des Phycodnaviridae..................................................................................27
Les chlorovirus, des phycodnaviridae pas comme les autres.........................................29
Structure du virion...........................................................................................................30
Cycle infectieux...............................................................................................................31
Génome............................................................................................................................33
Gènes...............................................................................................................................34
Histoire évolutive.............................................................................................................34
Les hôtes des Chlorovirus................................................................................................35
Le séquençage de l'ADN....................................................................................................38
Le pyroséquençage par Roche 454..................................................................................39
Le séquençage par ligature de sonde SOLiD...................................................................40
Séquençage par terminaison cyclique réversible Illumina / Solexa................................41
Séquenceurs de troisème génération................................................................................42
Un voyage au sein de la diversité des Chlorovirus ........................................45
Cinquante nouveaux génomes...........................................................................................47
Constitution du jeu de données........................................................................................47
Stratégie de séquençage...................................................................................................48
Résultats du séquençage..................................................................................................50
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Stratégie d'assemblage.....................................................................................................51
Résultats de l'assemblage.................................................................................................52
Prédiction des gènes........................................................................................................54
Comparaison des génomes..............................................................................................55
Le répertoire génétique des chlorovirus..........................................................................56
Nouvelles protéines chlorovirales....................................................................................58
Histoire évolutive des chlorovirus.....................................................................................61
Phylogénie moléculaire...................................................................................................61
Colinéarité des chlorovirus..............................................................................................62
Origine des gènes chloroviraux.......................................................................................64
Les gènes récents (non-ancestraux).................................................................................65
Les gènes ancestraux.......................................................................................................69
Conclusion...........................................................................................................................73
Méthodes.............................................................................................................................75
Isolation des virus............................................................................................................75
Isolation de l'ADN viral...................................................................................................75
Préparation des librairies et séquençage..........................................................................75
Contrôle qualité et assemblage des séquences.................................................................76
Annotation des génomes..................................................................................................77
Constitution des familles de protéines (clustering).........................................................77
Analyses phylogénétiques...............................................................................................78
Reconstruction du génome de l'ancêtre commun des chlorovirus...................................78
Indice de déviation de composition.................................................................................78
Etude transcriptomique de l'infection virale .................................................81
Activité transcriptionnelle globale....................................................................................83
Séquençage des ARN polyadénylés.................................................................................83
Cartographie du transcriptome........................................................................................83
Impact de l'infection sur le niveau transcriptionnel.........................................................86
Impact de l'infection sur l'expression des gènes..............................................................87
Expression différentielle chez NC64A............................................................................87
Expression différentielle chez PBCV-1...........................................................................89
Conclusions.........................................................................................................................90
Méthodes.............................................................................................................................92
Séquences de référence....................................................................................................92
Alignement des micro-reads............................................................................................92
Niveau d'expression des gènes........................................................................................92
Annotation fonctionnelle KEGG.....................................................................................93
Conclusion générale et perspectives ................................................................95
Annexes...............................................................................................................99
Références bibliographiques...........................................................................153
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Avant-propos
A la fin de mon stage de 2ème année de Master au laboratoire IGS durant lequel j'ai pu
étudier la conservation des séquences et structures régulatrices entre un virus (mimivirus) et
son hôte (A.castellanii), Guillaume Blanc, chargé de recherche au sein du même laboratoire,
m'a proposé de passer mon doctorat sous sa direction. En effet l'un des collaborateurs
étrangers du laboratoire, le professeur James L. Van Etten du Nebraska Center for Virology,
allait mettre à sa disposition les séquences brutes des génomes de 50 chlorovirus récemment
déterminées par la technologie Roche-454. C'était donc pour moi l'occasion rêvée de
continuer à développer mes compétences et mes connaissances en génomique virale.
Cependant, le séquençage des 50 génomes ayant finalement pris du retard au centre de
séquençage de l'université du Nebraska, j'ai complété ces travaux de thèse en procédant à la
réannotation complète du génome du chlorovirus PBCV-1 et à une analyse préliminaire visant
à caractériser le cycle infectieux d'un chlorovirus par une approche de transcriptomique. Mes
travaux de thèse avaient donc pour but (i) l'assemblage, l'analyse comparative et évolutive de
50 nouveaux génomes de chlorovirus et (ii) l'analyse préliminaire de données RNA-seq issues
du transcriptome de la chlorelle au cours de son infection par le chlorovirus PBCV-1. Ce
mémoire de thèse se compose donc d'une introduction sur la virologie et les chlorovirus, de
deux parties traitant des sujet énoncés puis se termine par une conclusion générale.
La première et principale partie de cette thèse rassemble les travaux que j'ai menés sur les
50 génomes de chlorovirus nouvellement séquencés par l'équipe de James L. Van Etten. J'y
présente la stratégie d'assemblage et d'annotation des génomes, ainsi que leur comparaison
tant au niveau structurel que génique afin de répondre à des questions telles que : les génomes
des différents chlorovirus sont-ils organisés de la même façon ? Quelles sont les différences /
similarités entre les gènes de deux chlorovirus infectant des hôtes différents ? Quelle est la
profondeur de la diversité génique de ces virus ? Dans un second temps, j'y aborde également
le sujet de l'évolution des chlorovirus en questionnant l'origine de leurs gènes et en comparant
le schéma évolutif des chlorovirus à celui d'autres virus géants.
La deuxième partie de cette thèse rassemble quant à elle mes analyses préliminaires
menées sur le transcriptome de la chlorelle, en l'occurence Chlorella variabilis NC64A, lors
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de son infection par le chlorovirus PBCV-1. Outre l'aspect méthodologique du traitement des
séquences issu du séquençage profond des ARNm du virus et de la chlorelle, j'y décris les
variations de l'expression des gènes de cette dernière en comparant les transcriptomes de deux
temps du cycle infectieux : avant infection et 20 minutes post-infection. Cette étude pilote
sera notamment complétée dans le futur par l'ajout de données transcriptomiques pour de
multiples temps différents au cours du cycle infectieux.
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