CARACTERIZAÇÃO ANATÔMICA DA ORGANOGÊNESE IN VITRO E TRANSFORMAÇÃO ...

157 Pages·2003·1.38 MB·Portuguese

CARACTERIZAÇÃO ANATÔMICA DA ORGANOGÊNESE IN
VITRO E TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA VIA Agrobacterium
tumefaciens EM Citrus sp.

WELITON ANTONIO BASTOS DE ALMEIDA

Tese apresentada à Escola
Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”, Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de
Doutor em Agronomia, Área de
Concentração: Fitotecnia.

PIRACICABA
Estado de São Paulo - Brasil
Setembro - 2002
CARACTERIZAÇÃO ANATÔMICA DA ORGANOGÊNESE IN
VITRO E TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA VIA Agrobacterium
tumefaciens EM Citrus sp.

WELITON ANTONIO BASTOS DE ALMEIDA
Engenheiro Agrônomo

Orientador: Prof. Dr. FRANCISCO DE ASSIS ALVES MOURÃO FILHO

Tese apresentada à Escola
Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”, Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de
Doutor em Agronomia, Área de
Concentração: Fitotecnia.

P I R A C I C A B A
Estado de São Paulo - Brasil
Setembro - 2002
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP

Almeida, Weliton Antonio Bastos de
Caracterização anatômica da organogênese in vitro e transformação
genética via Agrobacterium tumefaciens em Citrus sp. / Weliton Antonio
Bastos de Almeida. - - Piracicaba, 2002.
138 p. : il.
Tese (doutorado) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2002.
Bibliografia.
1. Bactéria fitopatogênica 2. Citricultura 3. Cultivo “in vitro” 4.
Morfogênese vegetal 5. Transformação genética I. Título
CDD 634.3

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
“O verdadeiro sábio é aquele que sabe, que o que ele sabe é um pouco do
muito que ele ainda não sabe”. Portanto, não é a instrução que nos faz
entender CRISTO, mas a pureza de coração.

Aos meus pais Almeida e Miralda, a
minha esposa Lília e aos meus filhos
Lucas e Aline.

DEDICO

Aos meus irmãos Walker, Jucinalva,
Janelera e Dayse.

OFEREÇO
AGRADECIMENTOS

A DEUS, que sempre me iluminou para enxergar e ter a consciência
dos percalços do meu caminho.
Ao Prof. Francisco de Assis Alves Mourão Filho, pela orientação,
confiança e atenção durante todo o trabalho.
À Profa. Adriana Pinheiro Martinelli Rodriguez, pela co-orientação,
incentivo, apoio, amizade e carinho.
À Profa. Beatriz Madalena Januzzi Mendes pela constante ajuda
profissional na realização deste trabalho.
Aos professores do Departamento de Produção Vegetal, pelos
ensinamentos e amizade.
À Escola de Agronomia da Universidade Federal da Bahia pelo
investimento profissional realizado na minha pessoa.
À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, em especial ao
Departamento de Produção Vegetal, pela oportunidade de realização deste
curso de Doutorado.
À CAPES-PICDT pela concessão da bolsa de estudos.
Ao Centro de Energia Nuclear na Agricultura pela permissão de
utilização da sua infra-estrutura durante a realização deste trabalho.
Aos amigos e amigas Adriana Pomarola, Alexandra Pavan, Fernando
Azevedo, Márcia Calixto, Maria Angélica e Vagner Benedito do Laboratório de
Biotecnologia Vegetal do Departamento de Produção Vegetal, pela ajuda, apoio
e convívio durante a realização deste trabalho.
Aos amigos e amigas Alessandra, Alice, Carolina (Carol), Fernanda,
Flávio, Girlene, Gustavo, Herika, Janaína, Joanne, Lílian, Liliane (Lili), Márcio,
v

Maria Graziela (Zizi), Nailton, Paulo Celso, Raquel e Sandra, do Laboratório de
Biotecnologia Vegetal do CENA pelo apoio e amizade.
Ao Prof. Carlos Alberto Labate e ao Pós-Doutorando Esteban González
pela grandiosa ajuda na realização da análise de Southern Blot.
Aos amigos Davi, Éder e Sr. José, funcionários do Departamento de
Produção Vegetal pela grandiosa ajuda durante a execução deste trabalho.
Ao amigo João Geraldo do Laboratório de Instrumentação e Informática
(USP/CENA), pelos serviços de computação gráfica.
Às amigas Bete, Célia, Luciane e Sra. Helena, secretárias do
Departamente de Produção Vegetal, pela amizade, avisos e convívio.
Aos amigos Carlos Estevão e família, Carlos Augusto e família,
Edmundo e família, Haury e Família, José Fernandes e família, Manoel e
família, Nivaldo e família, Onildo e família, Paulo Libardi e família, Pedro Louça
e família, Tadeu e família, Edmilson, Genelício, Laércio, Marcelo e Renato pelo
convívio fraterno e pelos momentos de grandes alegrias vivenciados na cidade
de Piracicaba, durante todo o tempo de realização deste curso.
À amiga Tereza Cristina pela constante lembrança, apoio e palavras de
incentivo a toda família durante este tempo que estivemos fora do convívio dos
nossos familiares.
A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a
realização deste trabalho.
SUMÁRIO

Página
LISTA DE FIGURAS.................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS...................................................................................... xi
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................... xiii
RESUMO..................................................................................................... xv
SUMMARY................................................................................................... xvii
INTRODUÇÃO.............................................................................................. 1
1 REVISÃO DE LITERATURA................................................................... 5
2.1 Melhoramento genético dos citros......................................................... 5
2.2 Transformação genética de plantas....................................................... 9
2.2.1 Aspectos gerais..................................................................................... 9
2.2.2 Transformação genética em citros...................................................... 14
2.3 Morfogênese in vitro………………………………………………………… 17
2.3.1 Morfogênese in vitro em espécies não cítricas................................. 19
2.3.2 Morfogênese in vitro em citros: ênfase a organogênese.................. 23
2.4 Considerações finais.................................................................................... 34
3 OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE ORGANOGÊNESE E REGENERAÇÃO
DE PLANTAS EM Citrus sinensis E Citrus limonia................................. 36
Resumo................................................................................................................ 36
Summary............................................................................................................... 37
3.1 Introdução....................................................................................................... 37
3.2 Material e Métodos........................................................................................ 39
3.2.1 Preparo do explante................................................................................... 39
3.2.2 Indução de brotações adventícias............................................................ 40
3.2.3 Indução de enraizamento dos brotos....................................................... 40
vii

3.3 Resultados e Discussão.......................................................................... 41
3.3.1 Indução de brotações adventícias...................................................... 41
3.3.2 Enraizamento das brotações.............................................................. 45
3.4 Conclusões............................................................................................... 49
4 CARACTERIZAÇÃO HISTOLÓGICA DA ORGANOGÊNESE ADVENTÍCIA IN
VITRO EM Citrus sinensis L. Osbeck..................................................... 50
Resumo........................................................................................................... 50
Summary......................................................................................................... 51
4.1 Introdução................................................................................................ 52
4.2 Material e Métodos................................................................................. 53
4.2.1 Cultivo in vitro....................................................................................... 53
4.2.2 Microscopia óptica e eletrônica de varredura.................................. 54
4.3 Resultados e Discussão........................................................................ 55
4.4 Conclusão............................................................................................... 62
5 TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM Citrus sinensis E Citrus limonia,
MEDIADA POR Agrobacterium tumefaciens UTILIZANDO SEGMENTOS DE
EPICÓTILO................................................................................................ 63
Resumo.......................................................................................................... 63
Summary........................................................................................................ 64
5.1 Introdução............................................................................................... 65
5.2 Material e Métodos............................................................................... 67
5.2.1 Origem, preparação e regeneração do material vegetal.............. 67
5.2.2 Linhagem de Agrobacterium.......................................................... 67
5.2.3 Transformação/seleção de material............................................... 68
5.2.4 Teste histoquímico GUS e análise de DNA................................... 69
5.3 Resultados e Discussão..................................................................... 70
5.4 Conclusões........................................................................................... 79

6 ORGANOGÊNESE E TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM TECIDO ADULTO
DE Citrus............................................................................................... 80
viii

Resumo...................................................................................................... 80
Summary.................................................................................................... 81
6.1 Introdução............................................................................................ 81
6.2 Material e Métodos........................................................................... 83
6.2.1 Material vegetal............................................................................ 83
6.2.2 Organogênese adventícia........................................................... 83
6.2.3 Análise microscópica.................................................................. 84
6.3.4 Transformação genética............................................................... 85
6.3.4.1 Linhagem de Agrobacterium................................................... 85
6.3.4.2 Transformação genética/Seleção e regeneração de plantas.... 86
6.3.4.3 Teste histoquímico GUS e análise de DNA............................ 87
6.4 Resultados e Discussão.................................................................. 87
6.4.1 Organogênese e caracterização histológica............................. 87
6.4.2 Transformação genética..................................................... 93
6.5 Conclusões........................................................................................ 100
7 CONCLUSÕES GERAIS................................................................ 101
ANEXO.................................................................................................... 103
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................... 110
APÊNDICE............................................................................................. 134
LISTA DE FIGURAS

Página

1 Indução de gemas adventícias e brotações enraizadas no cultivo
in vitro de segmentos de epicótilo de Citrus............................................... 41

2 Enraizamento de brotações de laranja ‘Natal’, laranja ‘Valência’,
laranja ‘Hamilin’ e de limão ‘Cravo’ em função de diferentes fontes
de auxina......................................................................................................... 48

3 Segmento de epicótilo de laranja ‘Valência’ no momento da introdução
in vitro e após 5 dias em meio de cultura contendo 1,0 mg.L-1 de BAP.. 57

4 Organogênese em segmentos de epicótilo de laranja ‘Valência’ após 10
e 15 dias em meio de cultura com 1,0 mg.L-1 de BAP............................. 58

5 Organogênese em segmentos de epicótilo da laranja ‘Valência’
após 20 e 25 dias em meio de cultura com 1,0 mg.L-1 de BAP............. 60

6 Seccionamento do explante na organogênese in vitro e na transformação
genética de laranja ‘Natal’, laranja ‘Valência’ e limão ‘Cravo’................ 75

7 Transformação genética a partir de segmentos de epicótilo
de laranja ‘Natal’, laranja ‘Valência’ e limão ‘Cravo’................................ 78

8 Organogênese in vitro em segmentos internodais e discos de folha
de plantas adultas da laranja ‘Hamlin’..................................................... 91