Aurélien FOTSO FOTSO INVESTIGATION DES FIÈVRES RÉCURRENTES EN AFRIQUE

97 Pages·2015·6.73 MB·French

AIX-MARSEILLE UNIVERSITÉ
FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ
Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Émergentes
URMITE – UMR 63, CNRS 7278, IRD 198, INSERM 1095

THÈSE DE DOCTORAT / Ph.D.
Présentée par
Aurélien FOTSO FOTSO

En vue de l’obtention du grade de Docteur de I’Université d’Aix-Marseille
Spécialité : Maladies Transmissibles et Pathologies Tropicales

INVESTIGATION DES FIÈVRES RÉCURRENTES EN
AFRIQUE

Soutenue le 29 Octobre 2015

COMPOSITION DU JURY

Président : Mr le Professeur Pierre-Edouard FOURNIER, Marseille
Rapporteur : Mr le Professeur Benoît JAULHAC, Strasbourg
Rapporteur : Mr le Professeur Angeli KODJO, Lyon
Co-directeur de thèse : Mr le Professeur François RENAUD, Montpellier
Directeur de thèse : Mr le Professeur Michel DRANCOURT, Marseille

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À mes parents FOTSO Jean Paul &TUENO Marie, en témoignage des

sacrifices consentis et des efforts déployés durant toutes mes études.

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REMERCIEMENTS

 Au Professeur Didier RAOULT, Directeur de l’Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses
et Tropicales Émergentes (URMITE), pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et de
l’évaluation formative lors des Work in progress.

 Au Professeur Michel DRANCOURT, mon directeur de thèse, qui a fait preuve d’une volonté
extrême pour la réalisation de ce travail en apportant son assistance morale et matérielle. Vos
critiques constructives et votre rigueur ont été la clé de la réalisation de ce travail. Je vous en sais
définitivement gré.

 Au Professeur François RENAUD, mon co-directeur de thèse, qui a toujours été attentif à mes
préoccupations avec son expertise sur les interactions génétiques entre hôtes et pathogènes.

 Aux différents membres du jury, merci d’avoir accepté d’évaluer ce travail et d’y apporter
toutes vos compétences. Je vous remercie très sincèrement de me faire l’honneur d’assister à ma
soutenance.

 A tous les ingénieurs et techniciens de l’URMITE en particulier Claude NAPPEZ, Saïd AZZA,
Annick ABEILLE et Muriel MILITELLO pour leurs formations, leurs entières disponibilités et
les conseils prodigués. Travailler à vos cotés a été une expérience très enrichissante.

 Enfin, j’exprime ma gratitude à tous ceux ou celles non nommés qui, de près ou de loin, ont œuvré
pour la bonne réussite de ce travail.

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AVANT PROPOS

Le format de présentation de cette thèse correspond à une recommandation de la spécialité
Maladies Infectieuses et Microbiologie, à l’intérieur du Master des Sciences de la Vie et de la
Santé qui dépend de l’École Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé de Marseille.
Le candidat est amené à respecter des règles qui lui sont imposées et qui comportent un
format de thèse utilisé dans le Nord de l’Europe et qui permet un meilleur rangement que les
thèses traditionnelles. Par ailleurs, la partie introduction et bibliographie est remplacée par
une revue envoyée dans un journal afin de permettre une évaluation extérieure de la qualité de
la revue et de permettre à l’étudiant de commencer le plus tôt possible une bibliographie
exhaustive sur le domaine de cette thèse. Par ailleurs, la thèse est présentée sur article publié,
accepté ou soumis associé d’un bref commentaire donnant le sens général du travail. Cette
forme de présentation a paru plus en adéquation avec les exigences de la compétition
internationale et permet de se concentrer sur des travaux qui bénéficieront d’une diffusion
internationale.

Professeur Didier RAOULT

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SOMMAIRE

DÉDICACE ................................................................................................................................ 2
REMERCIEMENTS .................................................................................................................. 3
AVANT PROPOS ...................................................................................................................... 4
SOMMAIRE .............................................................................................................................. 5
RÉSUMÉ .................................................................................................................................... 6
ABSTRACT ............................................................................................................................... 8
INTRODUCTION .................................................................................................................... 10
CHAPITRE I: REVUE DE LA LITTÉRATURE .................................................................... 12
Article 1 : Laboratory diagnosis of African relapsing fevers: State of the art ......................... 13
CHAPITRE II: IDENTIFICATION DES TIQUES ET BACTÉRIES ASSOCIÉES ............. 39
Article 2 : MALDI-TOF Mass Spectrometry detection of pathogens in vectors: the Borrelia
crocidurae/Ornithodoros sonrai paradigm .............................................................................. 41
Article 3 : Ubiquitous bacteria Borrelia crocidurae in Western African ticks Ornithodoros
sonrai ........................................................................................................................................ 48
CHAPITRE III: DIAGNOSTIC DES BORRÉLIOSES RÉCURRENTES CHEZ LES
PATIENTS ............................................................................................................................... 54
Article 4 : Genome sequence of Borrelia crocidurae strain 03-02, a clinical isolate from
Senegal ..................................................................................................................................... 56
Article 5 : Blood-borne Candidatus Borrelia algerica in a patient with prolonged fever in
Oran, Algeria ........................................................................................................................... 59
Article 6 : Monoclonal antibodies for the diagnosis of Borrelia crocidurae ..... ……………64
Brevet d’invention N° FR 2015/1461399 : Anticorps monoclonal spécifique de Borrelia
crocidurae et une méthode de diagnostic in vitro d’une fièvre récurrente de borréliose….....93
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ................................................................................... 96
RÉFÉRENCES ......................................................................................................................... 97

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RÉSUMÉ

En Afrique, les fièvres récurrentes causées par différentes espèces bactériennes du genre
Borrelia sont des infections négligées transmises par les arthropodes et sont responsables de
manifestations cliniques variant d’une septicémie mortelle à des formes plus bénignes et
d'autres manifestations cliniques, en particulier d'avortement chez les femmes enceintes.
Quatre espèces différentes de Borrelia, initialement séparées les unes des autres sur la base de
leur répartition géographique et de leur vecteur, sont actuellement cultivées de prélèvements
cliniques et de vecteurs : Borrelia crocidurae, Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis et
Borrelia hispanica. Ces différentes espèces circulent sur le continent africain en parallèle avec
au moins six espèces non encore cultivées et détectées dans des vecteurs. Notre travail est une
contribution à l’investigation des fièvres récurrentes à Borrelia en Afrique. Dans cette
perspective, nous avons mis au point la détection rapide en spectrométrie de masse MALDI-
TOF des Borrelia dans les tiques en créant au préalable une base de données Borrelia
MALDI-TOF-MS. La base de données de Borrelia et un logiciel de soustraction IHU ont été
utilisés pour détecter B. crocidurae dans 20 tiques Ornithodoros sonrai, y compris huit tiques
qui ont été testées positives pour B. crocidurae par PCR-séquençage, ce qui ouvre la voie à
l'utilisation du MALDI-TOF-MS pour la double identification des vecteurs et des agents
pathogènes vectorisés, dont il s’agissait du premier exemple maintenant étendu à d’autres
modèles dans notre laboratoire. Nous avons aussi montré la circulation non spécifique de B.
crocidurae au sein d’une collection de 35 tiques O. sonrai d’Afrique de l'Ouest infectées par
B. crocidurae. Ces tiques ont été génotypées par séquençage du gène de l’ARNr 16S
mitochondrial tandis que B. crocidurae a été génotypée par Multispacer Sequence Typing
(MST). Les 35 tiques ont été regroupées en 12 génotypes à forte structuration géographique et
les 35 B. crocidurae en 29 génotypes sans stricte structuration géographique. Un même
génotype d’O. sonrai portait plusieurs génotypes de B. crocidurae tandis qu’un même
génotype de B. crocidurae a été trouvé dans différents génotypes de différentes tiques.
Travaillant ensuite sur les prélèvements cliniques, nous avons réalisé dans le cadre de l’étude
du pangénome de B. crocidurae le séquençage et l'annotation du génome d’une souche isolée
au Sénégal à partir du sang d’un patient fébrile, B. crocidurae 03-02. Son génotype est
différent des cinq séquences MST et de celui de la souche de référence Achema, isolée à
partir d'une tique du genre Ornithodoros collectée en Mauritanie. Le génotypage in silico par
MST de B. crocidurae 03-02 a donné le génotype ST6, préalablement décrit chez les patients

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atteints de fièvre récurrente au Sénégal rural. Dans un autre travail, nous avons détecté par
biologie moléculaire une séquence indicative d'une nouvelle espèce de Borrelia nommée
Candidatus Borrelia algerica en étudiant 257 échantillons de sang prélevés chez les patients
fébriles à Oran, en Algérie. Le génotypage MST a révélé un pourcentage de similarité de 97%
avec B. crocidurae, B. duttonii et B. recurrentis. La construction de l’arbre phylogénétique
basé sur 735-pb du gène flaB a révélé que Candidatus B. algerica se situe dans le groupe des
fièvres récurrentes à Borrelia. Par la suite, nous avons produit 12 anticorps monoclonaux
contre B. crocidurae et caractérisé deux d'entre eux qui présentaient les titres les plus élevés,
dans la perspective du développement des tests de diagnostic rapide (TDR) pour le dépistage
des fièvres récurrentes à borreliae. L’anticorps monoclonal P3A10 réagit spécifiquement avec
la protéine flagelline B (flaB) de B. crocidurae et l’anticorps monoclonal P6D9 reconnaît la
protéine Vlp (variable like protein) de B. crocidurae et de B. duttonii. Les deux anticorps
pourraient être incorporés dans un dot-blot, un format stable bien adapté pour le diagnostic
rapide de la fièvre récurrente dans les laboratoires Point-of-Care dans les zones endémiques.

Mots-clés : Anticorps monoclonal, MALDI-TOF-MS, diagnostic, point-of-care, Borrelia
crocidurae, Ornithodoros sonrai

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ABSTRACT

In Africa, relapsing fever borreliae are neglected arthropod-borne pathogens causing mild to
deadly septicemia and other clinical manifestations, particularly abortion in pregnant women.
Four different species of Borrelia, initially distinguished one from another on the basis of
geography and vector, are currently cultured causative agents in Africa: Borrelia crocidurae,
Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis et Borrelia hispanica. These different species are
circulating in parallel to at least six not-yet cultured species in vectors. Our work consisted in
the investigation of recurrent fevers borreliosis in Africa. We have developed rapid detection
in MALDI-TOF mass spectrometry of Borrelia in ticks by creating a prior a Borrelia
MALDI-TOF-MS database. The Borrelia database and a custom software program that
subtracts the uninfected O. sonrai profile were used to detect B. crocidurae in 20 O. sonrai
ticks, including eight ticks that tested positive for B. crocidurae by PCR-sequencing; which
paves the way for the use of MALDI-TOF-MS for the dual identification of vectors and
vectorized pathogens. We have also illustrates a non-specialized circulation of B. crocidurae
borreliae within a collection of 35 O. sonrai ticks in West Africa. These ticks were genotyped
by 16S rRNA mitochondrial gene sequencing while B. crocidurae was genotyped by
Multispacer Sequence Typing (MST). The 35 ticks were grouped into 12 genotypes strong
geographic structuring and 35 B. crocidurae into 29 genotypes without strict geographic
structure. One O. sonrai genotype carried several B. crocidurae genotypes and one B.
crocidurae genotype was found in different O. sonrai genotypes. We performed the genome
sequencing of B. crocidurae strain 03-02, a blood isolate from a febrile Senegalese patient. In
silico multispacer sequence typing of B. crocidurae 03-02 strain found sequence type 6 (ST6),
a genotype previously found in patients with relapsing fever in rural Senegal. It differed in the
five spacer sequences used from the type strain Achema, isolated from an Ornithodoros tick
from Mauritania. We have detected by molecular tools a sequence indicative of a new
Borrelia sp. named Candidatus Borrelia algerica by tested 257 blood samples collected from
febrile patients in Oran, Algeria. Multispacer Sequence Typing indicated this Borrelia sp. had
97% similarity with B. crocidurae, B. duttonii and B. recurrentis. A phylogenetic tree based
on the 735-bp flaB gene was constructed and revealed that Candidatus B. algerica clustered
with relapsing fever borreliae. We produced 12 monoclonal antibodies (MAbs) against B.
crocidurae and characterized two of them which exhibited the highest titers in the perspective
of developing cheap assays for the rapid detection of relapsing fever borreliae. P3A10 MAb

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specifically reacts with the 35.6-KDa flagellin B (flaB) of B. crocidurae while P6D9 MAb
recognizes a 35.1-KDa variable like protein (Vlp) in B. crocidurae and a 35.2-KDa Vlp in B.
duttonii. Both antibodies could be incorporated into dot-blot, a stable format well suited for
the rapid diagnosis of relapsing fevers at the point-of-care laboratories in endemic areas.

Keywords : Monoclonal antibody, MALDI-TOF-MS, diagnosis, point-of-care, Borrelia
crocidurae, Ornithodoros sonrai

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INTRODUCTION

En Afrique, les fièvres récurrentes sont des zoonoses dues à des bactéries du genre Borrelia
de l’ordre des spirochètes. La transmission se fait par la piqûre de tiques molles du genre
Ornithodoros pour Borrelia crocidurae, Borrelia duttonii et Borrelia hispanica tandis que
Borrelia recurrentis est transmise par le poux de corps Pediculus humanus [1]. Ces maladies
sont géographiquement limitées par la répartition de la tique vectrice, que l’on retrouve en
zone rurale dans plusieurs pays d’Afrique de l’Ouest, de l’Est et au Maghreb [2,3]. C’est une
maladie endémique au Sénégal où B. crocidurae transmise par une tique molle O. sonrai dont
le taux moyen d’infestation est de 31%, est la seule espèce de Borrelia actuellement décrite
[2]. Les réservoirs sont des mammifères, des rongeurs et des insectivores, parmi lesquels la
prévalence moyenne de l’infection à B. crocidurae est de 9%, pouvant aller jusqu’à 30%
[3,4]. L’incidence de la maladie au Sénégal a été estimée à 5,1% par an, avec en moyenne
d'incidence de 11 pour 100 personnes entre la période 1996 et 2002 lors d’une étude effectuée
en zone rurale au Sénégal, en Mauritanie et au Mali [2]. La transmission de la bactérie se fait
lors d’une piqûre de tique, généralement indolore et nocturne (pendant le sommeil des
patients). Le premier épisode fébrile est brutal, avec une température corporelle pouvant
dépasser 40°C, d’une durée moyenne de trois à quatre jours. Après une accalmie transitoire au
cours de laquelle les patients semblent guéris, les accès fébriles alternent avec des phases
d’apyrexie de durée variable (deux à dix jours). D’autres signes sont inconstamment présents :
algies diffuses, frissons, troubles digestifs, toux et hépato-splénomégalie [3]. En Afrique du
Nord, B. hispanica a été détectée seulement au Maroc avec pour vecteur Ornithodoros
erraticus. En Tanzanie, où le taux de mortalité était d'environ 2,3%, B. duttonii est transmise
par Ornithodoros moubata et Ornithodoros porcinus [4]. La maladie représente un problème
majeur chez les femmes enceintes car elle occasionne une mortalité périnatale de 436 pour
1.000 naissances [5]. Plusieurs cas ont été décrits chez des voyageurs qui ont développé la
maladie après le retour en Afrique [6]. Le diagnostic des fièvres récurrentes chez l'homme
repose généralement sur la détection microscopique des borreliae sur un frottis sanguin, mais
ce test manque de sensibilité et n’a pas la capacité de différencier les différentes espèces. La
culture est fastidieuse et n’est pas une méthode de diagnostic en routine. L'introduction
récente de techniques moléculaires dans le diagnostic et la disponibilité de séquences
génomiques effectuées dans notre laboratoire et d’autres laboratoires fournissent une nouvelle
opportunité pour développer des méthodes moléculaires pour un diagnostic rapide et sensible

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