Экспрессия генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 в очагах поражения у больных очаговой склеродермией

5 Pages·0.102 MB·Russian

by  Потекаев Н.Н., Вавилов В.В. и др.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспрессия генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 в очагах поражения
у больных очаговой склеродермией
Н.Н. ПОТЕКАЕВ1,2, В.В. ВАВИЛОВ2,3, В.В. СОБОЛЕВ4, А.Г. СОБОЛЕВА4, А.Д. ЗОЛОТАРЕНКО4,
Э.С. ПИРУЗЯН4, И.М. КОРСУНСКАЯ3,5, С.А. БРУСКИН4
1РНИМ Университет им. Н.И. Пирогова; 2МНПЦДК Департамент здравоохранения Москвы; 3Первый МГМУ им. И.М. Сеченова;
4ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва; 5ФГБУН Центр теоретических проблем физико-химической
фармакологии РАН, Москва
ATF-1, ATF-3 and ATF-4 genes expression in affected skin specimen from patients with morphea
N.N. POTEKAEV, V.V. VAVILOV, V.V. SOBOLEV, A.G. SOBOLEVA, A.D. ZOLOTARENKO, E.S. PIRUZYAN,
I.M. KORSUNSKAYA, S.A. BRUSKIN
N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia; Moscow Research and Practical Center for
Dermatovenereology and Cosmetology, Moscow Healthcare Department; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University; Vavilov
Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow; Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology,
Russian Academy of Sciences
Проведено количественное измерение экспрессии генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 с помощью полимеразной цепной реакции
в реальном времени. Экспериментально показано изменение экспрессии данных генов в пораженной склеродермией
коже. Получена четкая картина статистически значимого увеличения экспрессии генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 в образцах
кожи, пораженной склеродермией. Сделано предположение о том, что данный параметр может использоваться в
качестве критерия состояния патологического процесса данного заболевания.
Ключевые слова: склеродермия, экспрессия гена, полимеразная цепная реакция в реальном времени, АР-1.
The RT-PCR based quantitative analysis of A transcription factor gene expression was carried out and showed the up-regulation
of ATF-1, ATF-3 and ATF-4 genes expression in morphea lesions. Overexpression of ATF-1, ATF-3 and ATF-4 genes in affected
skin samples was shown to be evident. These findings suggest the concept that these parameters may be used to evaluate the
activity of the pathologic process.
Key words: morphea, scleroderma, gene expression, RT-PCR, AP-1, TGF-β, ATF.
Нарушения сигнального пути трансформирую- генетическая клеточная пролиферация, дифферен-
щего ростового фактора β (TGF-β) принято считать цировка, трансформация, апоптоз, в ответ на дей-
ключевыми молекулярными механизмами развития ствие ряда внеклеточных факторов и разных сиг-
фиброза при склеродермии [1]. Известно, что нальных молекул, включая ростовые и паракринные
TGF-β повышает экспрессию генов, отвечающих за факторы, цитокины, онкогены, опухолевые промо-
1
синтез коллагена I, III, VI, VII, X типов, фибронек- торы, химические канцерогены, пептидные гормо-
тина и протеогликанов и играет ключевую роль в ны, нейротрансмиттеры [7]. Ранее на биоинформа-
активации фибробластов и повышенном отложении ционном уровне было показано участие генов се-
экстрацеллюлярного матрикса [2, 3]. В биоптатах мейства ATF, как компонентов транскрипционного
кожи пациентов с очаговой склеродермией была комплекса АР-1 в патогенезе таких социально зна-
выявлена повышенная реактивность TGF-β, а так- чимых заболеваний, как болезнь Крона и псориаз
же отмечается повышенный синтез рецепторов к [8, 9]. Экспериментально показано участие данных
данному фактору [4, 5]. Транскрипционные факто- генов в развитии псориатического и атеросклероти-
ры семейства AP-1 (activating protein 1) являются ческого процессов [10].
ключевыми сигнальными молекулами пути TGF-β Установлено, что ATF-2 участвует в регуляции
и вовлечены в транскрипционную регуляцию боль- TGF-β-зависимой экспрессии генов синтеза ком-
шого количества генов клеточной пролиферации и понентов межклеточного матрикса, при этом акти-
синтеза компонентов внеклеточного матрикса, вация ATF-2 осуществляется двумя путями: прямым
управляемых данным сигнальным каскадом [6]. путем непосредственного связывания SMAD3
Транскрипционный фактор (ATF) является од- (mothers against decapentaplegic homolog 3) и путем
ним из образующих компонентов транскрипцион- фосфорилирования TGF-β-активированной кина-
ного комплекса AP-1, который вовлечен в регуля-
цию ряда важнейших процессов, таких как морфо- 1,2e-mail: [email protected]
2,3e-mail: [email protected]
4e-mail: iogen(at)vigg.ru
© Коллектив авторов, 2013 5e-mail: [email protected]
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 6, 2013 13
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
зой-1 (ТАК-1-киназой) [11]. Также в исследованиях
псулгфутпнспеоитчсеороаанригнег е дккоиннолсип Ттлд,врсииаеор еае,ило Aвери тйкэвьв юа кTнискноэаяиат цмсFкнв огхвгпилесэ- ог риокрн3покеп,аеб а че саручемуррсеп е пттTссцан с поруTиизGисние тоGоэлиисинынлFкми сиF оотгхс-ви, емTеж- пβ авгюпгнβG1ыреие р р1ао теннт. иFкемве сеаоДрдэтг -слопвиосуикаβиьл ртюнн св1янAоа.ятпатн щочвмгаTецрыAейлнргууFеинярйгT оююсю,еаеио йсF тт ,т б нкиA р-Tнсжрароою3аTяыоG аем внт Fлтлхаа уFспсьнαе -ккскао- 3згоvтжимрβнеыд уйплиие1нолеа ио п[ пгянолчсβ1ввор цвьтев26ыа онT.ория] Tедшв—ы.еGзоКтGе зин ма Aм Fр удэFне о-оPдсвкиты-βмлнису-сβз1йяя1хе----,1 Cопутствующие заболевания НетГипертоническая болезнь, миома матки Сахарный диабет 2-го типа, хронический холециститГипотиреоз, поликистоз яичников НетНет Миома матки, гипертоническая болезнь, мочекаменная болезньФиброзно-кистозная мастопатия Язвенная болезнь желудка, х ронический холецистит, хроническая ишемия головно-го мозгаБронхиальная астма, варикозная болезнь, ожирение, гипертоническая болезнь, рецидивирующий генитальный герпес
транскрипционного комплекса при выраженном
развитии склеродермических изменений. Данное
имсесйлсетдвоав AаTнFие в проасзввяищтиеин оск илзеурчоеднеирюми рио.ли генов се- Размеры чагов, см2 см10 15, 5, 1 3 23 >30 5 >30 5
о
Материал и методы
-
ь
хсгуоскот доацимЗнев аооншбвттолидррееха нл б лнеиденыоечирпмеимнс д иаиМитйеоа оовгвснс еккуоноощзенворессмоску тло«лвоогьлгочтяиа анлитгсоаи яувви чану ян опк ос-оа-кпцспломирелееаринткокоттдллоиеиоврчгн,ме иписиикрчя оое»с---. яние бляшки ный очаг, локал ные очаги, отекные очаги, отек ные очаги, отекные очаги, отекные очаги, отекные очаги, отек, склероз,
ВДусоитзааргнанасовтзл пи«авоцачлиасгеоян вткаоляви свнкаилрчеьерисоркдоиев риамл б иоыятл» 2 пв5 о клдаетжтв еддроожм 7д 1се лнгуо чрдаеае-. Состо СклерозЭритематозный отекЭритематозлокальный Эритематозлокальный СклерозЭритематозлокальный Эритематозлокальный Эритематозлокальный Эритематозлокальный индурацияИндурация
зультатами патоморфологического изучения био-
пцсв(р3леаит келаичдт:и еоTузлпювоuоа вfщвцкfаaеиониnкежнеeан оиl)фlт.йi. ыо иД фСр иWм1ооа,ыргi гnлмн3 заk—ыоасeсбнl 6бmтоо,ыил aчл8екnев,илn са и,1бкн ун0лии )яибмя шоч:ии лебк ськлгикнеяр,оын шивйехт ед р енчикарналалибмааиялясземсю от(иир7вдф еаачг нлипеенинлкраосаееяь---- Локализация Кожа спиныКожа живота Живот, поясница, половой член,живот Кожа спиныКожа живота Кожа живота Кожа живота Кожа живота, верхних конечно-стейКожа паха, яго-диц, бедер
вышающие 3 см, в количестве более 4 на 1 анатоми-
чвоесвклуеюче онбилеа 2ст иь (б3о члеелео авнекатао: пмаицчиееснктиых 2о,б 7л аис 9т)е йи /(иплаи- есть) нная нная нная
й ж а а а
ц40и еснОмт,б зр9аа)нз. ицДмыиа кяаом ожебитшр б иоорлчньаынгоые вух ч свакаслртеькрииор тдоеевлраамл ( итоеатйб ли2. з 1 сп)м.о рдао- одермие орма (тя шечнаяерализов шечная шечная шечнаяшечная ерализов шечная ерализов шечная
р Ф ян я я яя н я н я
женного и непораженного участков кожи получали ле БлГе Бл Бл БлБл Ге Бл Ге Бл
к
с
под местной анестезией с помощью дерматологиче- х
снкыохг оу чпарсоткбоовй нкиокжаи (б4р малми) .н Ба ироапссстиоия нииз ин оекпоолроаж 3е снм- больны Число очагов14 1 3 13 1 2 >4 4
от пораженной кожи [13, 14]. Исследование одобре- и
л
но локальным комитетом по этике при Институте ате т,
оибзлщоежйе гненныетми вк иД РекАлНар иа цсоиоит Хвеетлсьтсвионвкаслкоо пгрои сноцглиапшаме-, е показ Возраслет4752 51 63 2826 61 59 67 68
ния. ки
РНК из биопсий выделяли на колонках Qiagen ичес Пол М.Ж. М. Ж. М.Ж. Ж. Ж. Ж. М.
по стандартному протоколу RNeasy Mini Kit для ко- ин
л
жсеий. ДДлНяК о спврообвоожддиелнии яо бпрраебпоатркаут оДв НРКНаКз оойт пQрiaиgмeеn-. ца 1. К № иента12 3 4 56 7 8 9 10
Концентрацию РНК измеряли на спектрофотоме- бли пац
тре NanoDrop 1000 («Thermo Scientific», США) по- а
Т
14 КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 6, 2013
Таблица 2. Последовательности праймеров и проб, используемые для определения уровня экспрессии соответствующих им генов
при помощи ПЦР-РВ
№ Ген Последовательность 5’—3’
1 GAPDH Набор праймеров и проба компании «ДНК-Синтез»
2 ATF-1 FAM-CGCGATCCGTCAGAGACAGCACCTCAACCGATCGCG-BHQ1
CACAGTTGATTATGGAAGATTC
TGATACCTGTTGAGCAATATG
3 ATF-3 FAM-ACCCAGTGCTGCTCTCCCATCTCCC-BHQ1
CTGAAGAAGAGGGTCTGCATTTTC
TCATCAAGCTGCGAGAGGAAG
4 ATF-4 FAM-CGCGATAACGCTGCTGCTGAATGCCGATCGCG-BHQ1
CTAATGGGAGTTGGCTTCTG
CGGTGCTTTGCTGGAATC
сле чего образцы выравнивали по концентрации в Результаты
ddHO.
2
Обратную транскрипцию проводили следую- На основании анализа литературы и баз данных
щим образом. В пробирки для полимеразной цеп- нами идентифицирован ряд генов, которые пред-
ной реакции (ПЦР) объемом 200 мкл вносили: бу- ставляются важными для экспериментального ис-
фер, dNTP, 100 ед обратной транскриптазы M_ следования. В их число входят гены, кодирующие
MLV («Promega»), 20 ед ингибитора РНКаз RNasin транскрипционный фактор AP-1 (ATF-1, ATF-3 и
(«Promega»), 500 нг oligo(dT)-праймеров (ДНК- ATF-4). Большой интерес для нас представляло
Синтез) и РНК до конечной концентрации не бо- сравнение уровней экспрессии этих генов в пора-
лее 100 нг/мкл. Смесь термостатировали 1 ч при женной части кожи больных склеродермией и визу-
37 °С. ально непораженной части кожи , находящейся на
ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили расстоянии около 3 см от пораженной склеродерми-
в 96-луночных оптических плашках с использова- ей кожи одного и того же больного. Такое сравнение
нием меченных флюоресцентными агентами олиго- позволяет максимально исключить влияние побоч-
нуклеотидных проб. Реакцию проводили с исполь- ных факторов на чистоту эксперимента [13, 16]. С
зованием 2,5-кратной реакционной смеси с рефе- использованием метода ПЦР-РВ проведен анализ
ренсным красителем ROX («Синтол»). Праймеры и уровня экспрессии генов АР-1 комплекса в пора-
пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез» женной склеродермией коже по сравнению с непо-
(табл. 2). раженной у 10 больных.
Амплификацию проводили в ПЦР-амплифика- При индивидуальном анализе каждого больного
торе (Bio-Rad, iQ4), используя следующую про- показано, что уровень экспрессии гена ATF-1 в по-
грамму: 1) денатурация при 95 °С в течение 4 мин, раженной склеродермией коже повышен относи-
2) денатурация при 94 °С в течение 15 с, 3) отжиг тельно визуально непораженной кожи (контроль) в
при 55 °С в течение 15 с, 4) элонгация при 72 °С в интервале от 1,1 (больной 8) до 4,8 (больной 2) раза.
течение 15 с, 5) этапы 2—4 повторяли 50 раз. Экс- Среднее значение изменения уровня экспрессии ге-
прессию генов-мишеней нормализовали на ген до- на оказалось повышенным в 3±0,8 раза (рис. 1).
машнего хозяйства GAPDH. Амплификация гена У пациентов 8 и 9 изменение экспрессии в поражен-
GAPDH и исследуемых генов проводилась в раз- ной коже достоверно не отличается от экспрессии в
ных пробирках. непораженной коже.
Для обсчета результатов использовались данные Уровень экспрессии гена ATF-3 в пораженной
реакции ПЦР-РВ со следующими параметрами: эф- склеродермией коже был повышен относительно
фективность праймеров в реакции ПЦР-РВ не ме- визуально непораженной кожи (контроль) от 2 раз
нее 95%. (больной 9) до 8 (больной 2) раз. Среднее значение
Результаты ПЦР обрабатывали методом 2-ΔΔCT, изменения уровня экспрессии гена оказалось повы-
который показывает, во сколько раз изменяется шенным в 4,5±1,3 раза (рис. 2).
экспрессия гена в пораженном образце по сравне- При измерении уровня экспрессии гена ATF-4 в
нию с непораженным [15]. ΔΔCt рассчитывали как пораженной склеродермией коже относительно ви-
ΔΔCt=ΔCt (пораженной кожи) — ΔCt (непоражен- зуально непораженной показано повышение от 1,2
ной кожи) и каждое значение ΔCt=Ct (исследуемый (больной 8) до 9,3 раза (больной 6). Среднее значе-
ген) — Ct(GAPDH). Эксперименты проводили в ние изменения уровня экспрессии гена оказалось
3 повторах для каждого образца [15]. повышенным в 4,7±2 раза (рис. 3). У пациента 8 из-
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 6, 2013 15
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 3. Уровень содержания мРНК гена ATF-4 в пораженной ко-
Рис. 1. Уровень содержания мРНК гена ATF-1 в пораженной ко-
же пациентов по отношению к уровню содержания в визуально
же пациентов по отношению к уровню содержания в визуально
непораженной склеродермией коже, принятому за 1.
непораженной склеродермией коже, принятому за 1.
может служить связующим звеном для разных сиг-
налов, направляя их эффекты в сигнальный путь
TGF-β [12]. Учитывая ключевую роль TGF-β в па-
1 1
тогенезе склеродермического процесса, повышен-
ная экспрессия ATF-3 в очагах склеродермии у па-
циентов может свидетельствовать о важной роли
данного фактора в регуляции функций TGF-β.
1
Усиление экспрессии гена ATF-4 у пациентов с
очаговой склеродермией было наибольшим, сред-
нее значение изменения уровня экспрессии гена
оказалось повышенным в 4,7±2 раза. Фактор ATF-4
усиливает экспрессию генов стресса эндоплазмати-
Рис. 2. Уровень содержания мРНК гена ATF-3 в пораженной ко- ческого ретикулума [18]. Предполагается, что дан-
же пациентов по отношению к уровню содержания в визуально
ный процесс способствует формированию фиброза
непораженной склеродермией коже, принятому за 1.
в ткани за счет активации проапоптотических пато-
логических путей, индукции эпителиально-мезен-
менение экспрессии в пораженной коже достоверно химальной транзиции и усилению воспалительного
не отличается от экспрессии в непораженной коже. ответа [19]. Кроме того, фактор ATF-4 принято счи-
Результаты, полученные с помощью метода тать одним из ключевых транскрипционных, уча-
ПЦР-РВ, свидетельствуют об увеличении экспрес- ствующих в клеточном ответе на оксидативный
сии генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 у всех пациентов в стресс путем усиления биосинтеза глутатиона. Про-
пораженной склеродермией коже. Патологическая демонстрировано, что фибробласты с дефицитом
активация экспрессии данных генов, как компонен- ATF-4 имели склонность к гибели на фоне искус-
тов транскрипционного комплекса АР-1, может ственного оксидантного стресса и депривации ами-
быть обусловлена их участием в TGF-β опосредо- нокислот [18]. Оксидантный стресс является одним
ванном пути развития фиброза и патологического из звеньев патогенеза склеродермии, в связи с чем
воспаления [17]. высокие уровни экспрессии ATF-4 в патологиче-
ATF-3 играет интегрирующую роль для сигналь- ских очагах могут свидетельствовать об адаптации
ного пути TGF-β, не только усиливая экспресссию ткани к его условиям и косвенно подтверждать его
его таргетных генов, но и регулируя экспрессию са- роль в патогенезе заболевания.
мого TGF-β по принципу положительной обратной Таким образом, можно сделать вывод о возмож-
связи. Транскрипционный фактор ATF-3 индуци- ной ключевой роли генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 в
руется большим количеством стрессовых сигналов и развитии склеродермии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Cotton S.A., Herrick A.L., Jayson M.V., Freemont A.J. TGF beta — a role in 3. O’Kane S., Ferguson M.W. Transforming growth factor beta and wound
systemic sclerosis? J Pathol 1998; 184: 1: 4—6. healing. Int J Biochem Cell Biol 1997; 29: 63—78.
2. Sano Y., Harada J., Tashiro S., Gotoh-Mandeville R., Maekawa T., Ishii S. 4. Higley H., Persichitte K., Chu S., Waegell W., Vancheeswaran R., Black C.
ATF-2 is a common nuclear target of Smad and TAK1 pathways in trans- Immunocytochemical localization and serologic detection of transforming
forming growth factor-β signaling. J Biol Chem 1999; 274: 13: 8949—8957. growth factor beta 1. Association with type I procollagen and inflammatory
16 КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 6, 2013
cell markers in diffuse and limited systemic sclerosis, morphea, and Rayn- 12. Yin X., Wolford C.C., Chang Y.S., McConoughey S.J., Ramsey S.A. et al.
aud’s phenomenon. Arthritis Rheum 1994; 37: 278—288. ATF3, an adaptive-response gene, enhances TGF(beta) signaling and can-
5. Kubo M., Ihn H., Yamane K., Tamaki K. Up-regulated expression of trans- cer-initiating cell features in breast cancer cells. J Cell Sci 2010; 123: 3558—
forming growth factor β receptors in dermal fibroblasts in skin sections from 3565.
patients with localized scleroderma. Arthritis Rheum 2001; 44: 731—734. 13. Kulski J., Kenworthy W., Bellgard M. et al. Gene expression profiling of
6. Chung K.Y., Agarwal A., Uitto J., Mauviel A. An AP-1 binding sequence is Japanese psoriatic skin reveals an increased activity in molecular stress and
essential for regulation of the human alpha2(I) collagen (COL1A2) pro- immune response signals. J Mol Med 2005; 85: 964—975.
moter activity by transforming growth factor-beta. J Biol Chem 1996; 271: 6: 14. Sonkoly E., Wei T., Janson P. et al. MicroRNAs: novel regulators involved in
3272—3278. the pathogenesis of Psoriasis? PLoS One 2007; 2: 7: е610.
7. Karin M., Liu Z., Zandi E. AP-1 function and regulation. Curr Opin Cell 15. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using
Biol 1997; 9: 2: 240—246. real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods
8. Пирузян Э.С., Ишкин А.А., Никольская Т.А. и др. Сравнительный ана- 2001; 25: 4: 402—408.
лиз молекулярно-генетических процессов при патогенезе псориаза и 16. Yao Y., Richman L., Morehouse C. et al. Type I interferon: potential
болезни Крона. Мол биол 2009; 43: 1: 175—179. therapeutic target for psoriasis? PLoS One 2008; 3: 7: e2737.
9. Пирузян Э.С., Никольская Т.А., Абдеев Р.М., Брускин С.А. Компоненты 17. Markovics J.A., Araya J., Cambier S., Somanath S., Gline S., Jablons D., Hill
транскрипционного фактора AP-1 как гены-кандидаты, участвую- A., Wolters P.J., Nishimura S.L. Interleukin-1beta induces increased
щие в развитии псориатического процесса. Мол биол 2007; 41: 1069— transcriptional activation of the transforming growth factor-beta-activating
1080. integrin subunit beta8 through altering chromatin architecture. J Biol
10. Соболев В.В., Стародубцева Н.Л., Пирузян А.Л. и др. Сравнительное Chem 2011; 286: 42: 36864—36874.
исследование экспрессии генов ATF-3 и ATF-4 в пораженных атеро- 18. Harding H., Zhang Y., Zeng H., Novoa I., Lu P., Calfon M., Sadri N., Yun C.,
склеротическим процессом сосудах и в коже при псориатическом Popko B., Paules R., Stojdl D., Bell J., Hettmann T., Leiden J, Ron D. An
процессе. Бюл экспер биол и мед 2011; 151: 6: 659—663. integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance
11. Sano Y., Harada J., Tashiro S., Gotoh-Mandeville R., Maekawa T., Ishii S. to oxidative stress. Mol Cell 2003; 11: 619—633.
ATF-2 is a common nuclear target of Smad and TAK1 pathways in trans- 19. Tanjore H., Blackwell T.S., Lawson W.E. Emerging evidence for endoplasmic
forming growth factor-β signaling. J Biol Chem 1999; 274: 8949—8957. reticulum stress in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis. Am J
Physiol Lung Cell Mol Physiol 2012; 302: L721—L729.
В №5 2013 г. в статье C.Г. Марданлы, В.А. Арсеньева, И.Н. Анискова, А.Р. Жигаленко «Отечественная тест-система
Лайн-Блот Сифилис-IgM для определения IgM-антител к Treponema pallidum методом линейного иммуноблоттинга»
допущена опечатка: вместо «тест-система Лайн-Блот Сифилис-IgG» следует читать «тест-система Лайн-Блот Сифилис-IgM».
Редакция приносит извинения за допущенную ошибку при подготовке текста статьи.
КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ 6, 2013 17