Application of Alpha-Repeat Proteins as Antiviral Molecules Against HIV-1 Targeting Viral ...

155 Pages·2017·9.71 MB·English

by  Sudarat Hadpech

Application of Alpha-Repeat Proteins as Antiviral
Molecules Against HIV-1 Targeting Viral Assembly or
Maturation
Sudarat Hadpech
To cite this version:
Sudarat Hadpech. Application of Alpha-Repeat Proteins as Antiviral Molecules Against HIV-1 Tar-
geting Viral Assembly or Maturation. Virology. Université de Lyon; Mahāwitthayālai Chīang Mai,
2017. English. ￿NNT: 2017LYSE1139￿. ￿tel-01628207￿
HAL Id: tel-01628207
https://theses.hal.science/tel-01628207
Submitted on 3 Nov 2017
HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents
entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de
teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires
abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
N°d’ordre NNT : 2017LYSE1139
THESE de DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE LYON
opérée au sein de
l’Université Claude Bernard Lyon 1
Ecole Doctorale ED341-E2M2
Evolution Ecosystèmes - Microbiologie Modélisation
et
University of Chiang Mai
Faculty of Associated Medical Sciences

Diplôme de Doctorat
Soutenue publiquement le 18 Juillet 2017
par :
Mlle Sudarat HADPECH
Nouveaux agents antiviraux dérivés de protéines cellulaires à motifs répétés
et ciblant l’assemblage du VIH
Devant le jury composé de :
M. le Professeur ANDRE Patrice Examineur
Mme. la Professeure CHAICAMPA Wanpen Rapporteure
M. le Professeur MINARD Philippe Rapporteur
Dr. KITIDEE Kuntida Rapporteure
Dr. YASAMUT Umpa Examinatrice
Dr. NANGOLA Sawitree Co-Directrice de Thèse
Dr. HONG Saw-See Directrice de Thèse
M. le Professeur TAYAPIWATANA Directeur de Thèse
UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1

Président de l’Université M. le Professeur Frédéric FLEURY
Président du Conseil Académique M. le Professeur Hamda BEN HADID
Vice-président du Conseil M. le Professeur Didier REVEL
d’Administration
Vice-président du Conseil Formation et M. le Professeur Philippe CHEVALIER
Vie Universitaire
Vice-président de la Commission M. Fabrice VALLÉE
Recherche
Directrice Générale des Services Mme Dominique MARCHAND

COMPOSANTES SANTE

Faculté de Médecine Lyon Est – Claude Directeur : M. le Professeur G.RODE
Bernard
Directeur : Mme la Professeure C.
Faculté de Médecine et de Maïeutique
BURILLON
Lyon Sud – Charles Mérieux
Faculté d’Odontologie Directeur : M. le Professeur D.
BOURGEOIS
Institut des Sciences Pharmaceutiques et Directeur : Mme la Professeure C.
Biologiques VINCIGUERRA
Institut des Sciences et Techniques de la Directeur : M. X. PERROT
Réadaptation
Département de formation et Centre de Directeur : Mme la Professeure A-M.
Recherche en Biologie Humaine SCHOTT

1
COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE

Faculté des Sciences et Technologies Directeur : M. F. DE MARCHI
Directeur : M. le Professeur F.
Département Biologie
THEVENARD

Département Chimie Biochimie Directeur : Mme C. FELIX
Département GEP Directeur : M. Hassan HAMMOURI
Département Informatique Directeur : M. le Professeur S.
AKKOUCHE

Département Mathématiques Directeur : M. le Professeur G.
TOMANOV

Département Mécanique Directeur : M. le Professeur H. BEN
HADID

Département Physique Directeur : M. le Professeur J-C
PLENET
UFR Sciences et Techniques des Directeur : M. Y.VANPOULLE
Activités Physiques et Sportives

Observatoire des Sciences de l’Univers Directeur : M. B. GUIDERDONI
de Lyon

Polytech Lyon Directeur : M. le Professeur E.PERRIN
Ecole Supérieure de Chimie Physique Directeur : M. G. PIGNAULT
Electronique

Institut Universitaire de Technologie de Directeur : M. le Professeur C. VITON
Lyon 1

Ecole Supérieure du Professorat et de Directeur : M. le Professeur A.
l’Education MOUGNIOTTE
Institut de Science Financière et Directeur : M. N. LEBOISNE
d'Assurances

2
Résumé de la thèse en Français
Au cours de notre programme de thèse, nous avons isolé et caractérisé des
molécules protéiques à activité antivirale intracellulaire dirigée contre le VIH-1. Ces
protéines, appelées αRep, ont été obtenues par criblage d'une banque de protéines
artificielles de nouvelle génération, construites de façon combinatoire à partir de protéines
naturelles constituées de motifs alpha-hélicoidaux répétés. La cible virale (ou "appât")
utilisée pour ce criblage est une région de la polyprotéine Gag du VIH-1 identifiée comme
une cible privilégiée de nouvelles thérapeutiques antivirales, car essentielle à
l'assemblage viral, l'empaquetage du génome viral et le clivage de maturation de Gag
aboutissant à la formation de virions infectieux. Deux molécules d'αRep à forte affinité
pour la cible virale, l'αRep4E3 (32 kDa; 7 motifs répétés) et l'αRep9A8 (28 kDa; 6 motifs
répétés) ont ainsi été isolées, clonées et caractérisées. L'étude de l'activité anti-VIH
intracellulaire de ces αRep a été réalisée dans différents systèmes d'expression cellulaire,
nécessitant la construction de lignées stables de cellules d'insecte et de cellules
épithéliales humaines, et leur infection par différents types de vecteurs viraux
recombinants, baculovirus ou lentivirus, porteurs du gène rapporteur luciférase. Mais
surtout, notre étude a été menée sur des cellules lymphocytaires-T (SupT1), cibles
naturelles du virus, exprimant ces αRep et infectées par du VIH-1 naturel infectieux. Nos
résultats ont montré que l'αRep4E3 et l'αRep9A8 ont toutes deux un effet négatif
significatif sur le cycle réplicatif du VIH-1, mais ciblent des fonctions virales différentes.
L'αRep4E3 bloque l'empaquetage du génome viral, tandis que l'αRep9A8 inhibe la
maturation et diminue l'infectivité virale. De plus, l'αRep9A8, exprimée de façon
constitutive dans les cellules SupT1, leur confère une résistance au VIH: une lignée de
SupT1 chroniquement infectée par le VIH-1 a pu être ainsi isolée et maintenue en culture
pendant plusieurs semaines, sans effet cytopathique viro-induit apparent. Ces nouvelles
données auront des implications non-négligeables dans le choix et la conduite de futures
stratégies de thérapie cellulaire anti-VIH.
Mots-clés: VIH-1; antivirals; designed molecular scaffolds; HEAT-like repeat; αRep
protéine
3
ABSTRACT
Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection is a long-term disease
which required a long-life treatment. Besides the standard highly active retroviral therapy
(HAART) regiment, HIV-1 gene therapy is one of a promising alternative strategy which
give rise to hope for better HIV-1 treatments. In addition, protein-based therapeutics
represent another promising approach which show the high impact results in curing
various types of diseases. Nowadays, it has already become a significant part of the
current medical treatments. In this study, we focused on αRep proteins, the non-
immunoglobulin scaffold proteins which were designed to target nucleocapsid (NC)
domain of HIV-1 Pr55Gag polyprotein precursor and investigated their possible roles as
intracellular therapeutic agents. Phage display technology was used for the specific
isolation of αRep against a critical C-terminal region of the HIV-1 Pr55Gag (CA -SP1-
21
NC) from a large and diverse αRep phage library. Several strong αRep binders were thus
isolated, but only two binders, referred to as αRep4E3 and αRep9A8, were further
characterized. The αRep4E3 contains 7 internal repeat motifs (32 kDa), whereas
αRep9A8 has 6 repeat motifs (28 kDa). Both αRep proteins were expressed at high level
in a conventional bacterial expression system, and were recovered at high yields in
soluble form. Their potential antiviral activity was investigated using different cell
systems. The baculovirus system was used for determining the antiviral effects on
virus-like particle (VLP) production of both αRep scaffold molecules. Sf9 cells stably
expressing N-myristoylated αRep4E3 and αRep9A8 fused to the GFP reporter protein at
their C-termini were infected with a recombinant baculovirus carrying the gene encoding
the HIV-1 Pr55Gag polyprotein (AcMNPVgag), and the antiviral effects were evaluated
by quantitative and qualitative methods. The results showed that N-myristoylated
αRep4E3 and αRep9A8 qualitatively altered the particle formation and were
coencapsidated with Pr55Gag into the VLPs released into the culture supernatant.
The different patterns of particle morphology were observed by electron microscopy.
The αRep4E3-expressing cells mainly produce aberrant VPLs, while αRep9A8
expression induces the accumulation of Pr55Gag at the plasma membrane of
4
AcMNPVgag-infected Sf9 cells. In the human T cell line system, αRep4E3 and αRep9A8
proteins were expressed intracellularly by transducing SupT1 cell with SIN CGW
lentiviral vector carrying the αRep genes fused to the EGFP coding sequence at their
3'-end. These stable SupT1 cell lines were then challenged with HIV-1 .The results
NL4-3
indicated that both αRep4E3 and αRep9A8 displayed antiviral effects, which occurred at
the late steps of the HIV-1 life cycle, with no effect on proviral DNA integration.
Reduction and delay in the viral progeny production were found in infected SupT1
expressing αRep4E3-EGFP and αRep9A8-EGFP. Difference in the antiviral mechanism
was observed between these two αRep proteins: αRep4E3-EGFP mainly interferes with
the packaging of the viral genomic RNA, while αRep9A8-EGFP interferes with the
proteolytic processing of Pr55Gag polyprotein, and performs as a protease inhibitor to
prevent the HIV-1 protease cleavage which is required for the production of newly
infectious mature virions. Interestingly, SupT1 expressing αRep9A8-EGFP is able to
survive to chronical HIV-1 infection up to 38 days after infection, with a low level of
noninfectious HIV-1 particle production. Taken together, our results suggested that αRep,
a new type of scaffold protein, could serve as a promising alternative antiviral agent which
would influence the future strategies and candidates of antiviral molecules to be used in
anti-HIV-1 cell therapy.
Keywords: HIV-1; antivirals; designed molecular scaffolds; HEAT-like repeat; αRep
proteins

5
บทคดั ย่อ
การติดเช(cid:202)ือไวรัสเอชไอว ี1 ก่อใหเ้กิดโรคติดเช(cid:202)ือเร(cid:202)ือรังที(cid:201)ตอ้ งรักษาตลอดชีวิต นอกเหนือไปจาก
การรักษาดว้ ยยาตา้ นไวรัสซ(cid:201)ึงเป็นการรักษามาตรฐานในปัจจุบนั แลว้ การรักษาดว้ ยยีนถือเป็นอีกหน(cid:201)ึง
แนวทางใหม่ที(cid:201)ช่วยเพิ(cid:201)มความหวงั ในการรักษาให้ดีข(cid:202)ึน โดยทาํ การออกแบบยีนที(cid:201)กาํ หนดการสร้าง
โมเลกุลที(cid:201)มีประสิทธิภาพในการยบั ย(cid:202)งั การแบ่งตวั ของเช(cid:202)ือไวรัส ในการศึกษาน(cid:202)ีเป็นคร(cid:202)ังแรกที(cid:201)ใช้ยีน
สําหรับสร้างโปรตีนแอลฟารีพีทซ(cid:201)ึงเป็นโปรตีนโครงสร้างพิเศษที(cid:201)แตกต่างไปจากแอนติบอดี
มาทดสอบการยบั ย(cid:202)งั วงจรชีวิตของไวรัสเอชไอวี 1 โดยทาํ การคดั เลือกโปรตีนแอลฟารีพีทที(cid:201)สามารถ
จบั ไดก้ บั บริเวณนิวคลีโอแคพซิด ซ(cid:201)ึงเป็นส่วนหน(cid:201)ึงของโปรตีนโครงสร้างของเช(cid:202)ือไวรัสโดยเทคนิค
ฟาจดิสเพลย์ พบว่าสามารถคัดเลือกโปรตีนแอลฟารีพีทโคลนที(cid:201)จับอย่างจาํ เพาะได้ 2 โคลนคือ
สี(cid:201)อีสาม (αRep4E3) และเก้าเอแปด (αRep4E3) ซ(cid:201)ึงโปรตีนแอลฟารีพีทดงั กล่าวน(cid:202)ีประกอบไปด้วย
จาํ นวนรีพีท 7 รีพีท มีขนาดโมเลกุล 32 กิโลดาลตนั และ 6 รีพีท มีขนาดโมเลกุล 28 กิโลดาลตนั
ตามลาํ ดบั โปรตีนท(cid:202)งั สองโมเลกุลมีระดบั การแสดงออกที(cid:201)สูงและมีความคงตวั สูงในเซลล์หลายชนิด
ท(cid:202)งั ในแบคทีเรีย เซลล์แมลง และเซลล์มนุษย ์จากน(cid:202)นั นาํ ยีนของโปรตีนท(cid:202)งั สองโคลนน(cid:202)ีเขา้ สู่เซลล์เพื(cid:201)อ
ทดสอบฤทธ(cid:205)ิในการยบั ย(cid:202)งั วงจรชีวิตของเช(cid:202)ือไวรัสภายในเซลล ์ท(cid:202)งั ในเซลล์แมลงชนิดเอสเอฟเกา้ (Sf9)
และในเซลล์เม็ดเลือดขาวของมนุษยช์ นิดทีเซลล์ (SupT1)ซ(cid:201)ึงการทดสอบผลของแอลฟารีพีทท(cid:202)งั สอง
ในการรบกวนการผลิตอนุภาคเสมือนไวรัส (VLP) โดยใช้เซลล์แมลงน(cid:202)ัน ได้ทาํ การออกแบบให้
โปรตีนแอลฟารีพีทมีการแสดงออกในรูปแบบที(cid:201)มีไมริสติกแอซิดติดอยู่ด้านทางปลายอะมิโนและ
เชื(cid:201)อมต่อโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) เขา้ ไปทางด้านปลายคาร์บอกซิลิค จากน(cid:202)ันจึงติดเช(cid:202)ือเซลล์
ดงั กล่าวดว้ ยแบคคูโลวสั ไวรัส AcMNPVgag ที(cid:201)ทาํ หนา้ ที(cid:201)ในการนาํ ส่งยีนกาํ หนดการสร้างโปรตีนแกก
(Gag) ของไวรัสเอชไอวี 1 และติดตามผลการรบกวนการสร้าง VLP ในเซลล์ดงั กล่าว จากผลการ
ทดลองพบว่าโปรตีนแอลฟารีพีทท(cid:202)งั สองมีผลทาํ ให้การกระกอบอนุภาคของไวรัสแปรเปลี(cid:201)ยนไปใน
เชิงคุณภาพ พบรูปแบบที(cid:201)แตกต่างกนั ทางสัณฐานวิทยาของ VLP ซ(cid:201)ึงเป็นผลมาจากฤทธ(cid:205)ิของโปรตีน
แอลฟารีพีทเมื(cid:201)อศึกษาโดยใชก้ ลอ้ งจุลทรรศน์อิเล็กตรอน โดยสังเกตพบวา่ αRep4E3 มีฤทธ(cid:205)ิส่งเสริม
ให้มีการผลิต VLP ที(cid:201)มีรูปร่างผิดปกติ ในขณะที(cid:201) αRep9A8 มีผลทาํ ให้เกิดการสะสมของโปรตีน Gag
ที(cid:201)ผนงั เซลล์ Sf9 และพบอีกวา่ โปรตีนแอลฟารีพีทท(cid:202)งั สองถูกบรรจุเขา้ ไปในอนุภาค VLP จากน(cid:202)นั จึง
ทาํ การศึกษาฤทธ(cid:205)ิของโปรตีนแอลฟารีพีทต่อในเซลล์เม็ดเลือดขาวของมนุษย์ชนิด SupT1 โดยได้
ออกแบบโปรตีนแอลฟารีพีทท(cid:202)งั สองให้มีการแสดงออกภายในเซลล์ได้อย่างต่อเนื(cid:201)องโดยได้เชื(cid:201)อม

6
EGFP ไวท้ างดา้ นปลายปลายคาร์บอกซิลิคของโปรตีน จากน(cid:202)นั ทาํ การติดเช(cid:202)ือเซลล์ที(cid:201)มีการแสดงออก
ของโปรตีนแอลฟารีพีทท(cid:202)งั สองชนิดดว้ ยไวรัสเอชไอวีที(cid:201) 1 สายพนั ธุ์ NL4-3 ที(cid:201) 1 MOI ติดตามผลการ
ทดลองพบวา่ โปรตีนแอลฟารีท(cid:202)งั สองตวั มีความสามารถในการตา้ นการเพิ(cid:201)มจาํ นวนของไวรัสและพบ
อีกวา่ โปรตีนแอลฟารีพีทท(cid:202)งั สองออกฤทธ(cid:205)ิในช่วงทา้ ยของวงจรชีวิตของเอชไอวีโดยที(cid:201)ไม่มีผลในการ
ยบั ย(cid:202)งั การฝังตวั ของดีเอ็นของไวรัสในโครโมโซมของเซลล์ติดเช(cid:202)ือ นอกจากน(cid:202)นั พบว่าไวรัสตวั ใหม่
สร้างไดน้ อ้ ยลงและชา้ ลงในเซลล์ที(cid:201)มีการแสดงออกของโปรตีนแอลฟารีพีทท(cid:202)งั สอง และยงั พบอีกว่า
กลไกในการยบั ย(cid:202)งั ไวรัสน(cid:202)นั แตกต่างกนั ระหวา่ งโปรตีนแอลฟารีพีทท(cid:202)งั สองตวั โดย αRep4E3 มีฤทธ(cid:205)ิ
ในการรบกวนการบรรจุอาร์เอ็นเอจีโนมเข้าไปในอนุภาคไวรัส ในขณะที(cid:201) αRep9A8 พบว่ามีการ
รบกวนกระบวนการสร้างไวรัสที(cid:201)สมบูรณ์ (maturation)โดยทาํ หน้าที(cid:201)เสมือนเป็นตวั ขดั ขวางเอ็นไซม์
โปรติเอสไม่ให้สามารถเขา้ ตดั โปรตีน Gag ได ้ซ(cid:201)ึงข(cid:202)นั ตอนดงั กล่าวน(cid:202)ีมีความจาํ เป็นสําหรับการผลิต
ไวรัสตัวเต็มวยั ตัวใหม่ อีกท(cid:202)ังยงั พบประเด็นที(cid:201)น่าสนใจว่าเซลล์ SupT1 ที(cid:201)มีการแสดงออกของ
αRep9A8 สามารถรอดชีวิตนานถึง 38 วนั ในสภาวะที(cid:201)เป็นการติดเช(cid:202)ือเร(cid:202)ือรัง พบการสร้างไวรัสตวั ไม่
เตม็ วยั และไม่มีความสามารถในการติดเช(cid:202)ือออกมาในน(cid:202)าํ เพาะเล(cid:202)ียงในระดบั ต(cid:201)าํ จากการศึกษาท(cid:202)งั หมดน(cid:202)ี
สามารถกล่าวไดว้ า่ โปรตีนแอลฟารีพีทเป็นโปรตีนชนิดใหม่ซ(cid:201)ึงถือเป็นทางเลือกที(cid:201)น่าสนใจสาํ หรับการ
นาํ มาใชใ้ นการพฒั นาเป็นโมเลกุลตา้ นไวรัสและสามารถนาํ มาต่อยอดเพื(cid:201)อการพฒั นาเซลล์ตา้ นไวรัส
เอชไอวเีพื(cid:201)อใชใ้ นการรักษาได ้

7
ACKNOWLEDGEMENTS

This thesis is the story which has been arisen for several years in my Ph.D. study.
I would say that it is such a great and wonderful memories. However, I will never forget
experiencing many important lessons, hard examinations, late night experiments and the
stressful I have when I wrote this thesis. During my study program, I have had a very
great honor to work with a large number of amazing people. It would not have been
possible to finish this thesis without their warm help, support, guidance, and friendship.
It also would not have been possible to finish this thesis without financial support
throughout my education. I would like to take this opportunity to express that this thesis
is the result of many experiences I have encountered from dozens of remarkable
individuals who I wish to acknowledge.
First and foremost I wish to express my deepest gratitude and sincere appreciation
to my thesis supervisor, Prof. Dr. Chatchai Tayapiwatana, for giving me a great
opportunity to be a Ph.D. student under his supervision. It has been a great honor to be
his student, not only because of his tremendous academic support but also because he is
one of the great teachers and researchers I have ever met in my life. His guidance helped
me in all the time of studying and writing of this thesis. He has always made himself
available to clarify my doubts despite his busy schedules. I could not have imagined
having a better advisor and mentor for my Ph.D. study. He is the type of person called
"polymath" which means "a man can do all things if he would like to". I really wish that
someday I could be as enthusiastic and energetic as Prof. Chatchai and to someday be
able to command an audience as well as he can.
I am extremely grateful to express my gratitude and appreciation to Dr. Saw-See
Hong and Prof. Pierre Boulanger, my thesis advisors from UMR754, UCBL, and my
parents in Lyon for their support, guidance, and taking care of me. They are the beginning
of alpha repeat proteins project, the beginning of this thesis work. Dr. Saw-See is the one
that changed my perspective on life. I see things more in a positive way after I know her.
I have learned to be more kind, sweet, and be a positive thinking person than I was.
8