aplicação de técnicas de ressonância magnética nuclear ao estudo de processos dinâmicos em

242 Pages·2009·20.29 MB·Portuguese

JOSÉ AUGUSTO CALDEIRA PEREIRA
Lî€lMCIA80 1M llOQOlMICA (U.P.)
APLICAÇÃO DE TÉCNICAS DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
AO ESTUDO DE PROCESSOS DINÂMICOS EM SOLUÇÃO
Dissertação para Doutoramento em Química na
Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
DEPARTAMENTO DE <
FACULDADE DE CIÊNCIAS DO POETO
FOITO
1994
APLICAÇÃO DE TÉCNICAS DE
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR AO
ESTUDO DE PROCESSOS DINÂMICOS EM SOLUÇÃO
JOSÉ AUGUSTO CALDEIRA PEREIRA
LICENCIADO EM BIOQUÍMICA (U.P.)
APLICAÇÃO DE TÉCNICAS DE
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR AO
ESTUDO DE PROCESSOS DINÂMICOS EM SOLUÇÃO
Dissertação para Doutoramento em Química na
Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
FACULDADE DE CIÊNCIAS DO PORTO
PORTO
1994
"Se pudéssemos (...) traduzir filosoficamente o duplo movi
mento que actualmente anima o espírito científico aperceber-
-nos-íamos de que a alternância do a priori e do a posteriori é
obrigatória, que o empirismo e o racionalismo estão ligados
no pensamento científico, por um estranho laço, tão forte
como o que une o prazer à dor."
Gaston Bachelard, "Filosofia do Novo Espírito Científico"
índice
Prefácio xi
Agradecimentos xiii
I Enquadramento Teórico i
1 Aspectos da química biológica dos catiões bivalentes do grupo 12 3
1. A importância dos catiões metálicos para a vida 3
2.0 papel biológico do zinco 5
3. Aspectos biológicos da química do cádmio e do mercúrio 7
4. Aspectos da química de complexação dos catiões do grupo 12 11
5. Complexos ternários mistos e a sua importância para a química biológica 12
2 Ressonância Magnética Nuclear 15
1. Aspectos básicos da descrição semi-clássica de RMN 15
1.1 Fundamentos a nível nuclear 15
1.2 Fundamentos a nível macroscópico 16
Equações diferenciais de Bloch \ J
1.3 O desvio químico 22
1.4 Acoplamento intemuclear indirecto 24
1.5 Permuta química 25
1.6 Relaxação 26
1.7 Aspectos práticos instrumentais 29
2. Formalismo de operadores para a descrição de experiências de RMN 32
2.1 Operadores de spin 32
2.2 Hamiltoniano de spin nuclear 32
2.3 O operador densidade 33
Expansão do operador densidade em operadores produto 34
Evolução dos operadores produto 3 5
Mapas de ordem de coerência 36
3. Descrição semi-clássica da relaxação em RMN 38
3.1 Teoria BPP da relaxação em RMN 38
3.2 Superoperador de relaxação 39
HamUtonianos de interacção 42
4. Algumas técnicas relevantes de RMN-FT 44
4.1 Supressão do sinal do solvente 44
4.2 Espectros bidimensionais 45
4.3 Medição de 7, e de T 46
2
3 Constantes de equilíbrio químico e sua determinação por RMN 49
1. Constantes de estabilidade de complexos 49
Terminologia 49
Complexos ternários mistos 50
Aspectos termodinâmicos do equilíbrio químico $ 1
Estado de referência 53
viii
ÍNDICE
2. Cálculo de constantes de estabilidade por RMN 54
2.1 Regressão sobre os desvios químicos de RMN 55
Regressão linear 55
Regressão não linear 60
2.2 Regressão sobre as constantes de tempo de relaxação 61
II Determinação de Constantes de Estabilidade por RMN 63
4 Condições experimentais gerais e métodos de cálculo 65
1. Solventes e reagentes 65
2. Preparação de amostras para RMN 66
Medição do pH 67
3. Condições experimentais utilizadas na obtenção dos espectros de RMN 68
4. Escolha da referência interna 69
5. Os dados experimentais e o cálculo das constantes de equilíbrio 72
5.1 Os conjuntos de pontos experimentais: critérios usados na sua selecção 73
5.2 A escolha dos modelos 74
5.3 A apresentação dos valores calculados para as constantes de equilíbrio 76
5.4 O cálculo de constantes de equilíbrio para o modelo M + L ^* ML 76
5.5 Implementação do método geral de regressão não linear
para o cálculo de constantes de equilíbrio 77
5 Associações intermoleculares e constantes de acidez da glicilglicina e da citidina 85
1. Citidina, glicilglicina e a sua interacção 85
1.1 Interpretação do espectro de RMN da citidina em H 0 e D 0 85
2 2
1.2 Interpretação do espectro de RMN da glicilglicina em H 0 e em D 0 88
2 2
1.3 Efeitos nos espectros de RMN da auto-associação da citidina e da interacção
intermolecular entre a citidina e a glicilglicina 89
2. Constantes de acidez da citidina e da glicilglicina 90
2.1 Glicilglicina 92
Definição do estado de referência para as experiências de pH variável com glicilglicina 96
2.2 Citidina 98
Definição do estado de referência para as experiências de pH variável com citidina 99
3. Conclusão 100
6 Zinco e cádmio: complexos binários e ternários mistos com citidina e glicilglicina 101
1. Constantes de estabilidade para os complexos binários de Zn2+ e Cd2+ com citidina 102
1.1 Variação do desvio químico em função da concentração de catião metálico (pH fixo);
efeito dos catiões e dos aniões 102
Cálculo de constantes de estabilidade 109
1.2 Variação do desvio químico em função do pH 114
2. Constantes de estabilidade para os complexos binários de Zn2+ e Cd2+ com glicilglicina 118
3. Constantes de estabilidade para os complexos mistos de Zn2+ e Cd2+ com
glicilglicina e citidina 125
3.1 Variação do desvio químico em função da concentração de catião metálico (pH fixo) 127
Cooperatividade na formação dos complexos ternários 130
3.2 Variação do desvio químico em função do pH 132
4. Conclusão 136
ÍNDICE ix
7 Mercúrio: formação de complexos com citidina e glicilglicina 139
1. Glicilglicina 139
1.1 Estudo das espécies em solução 140
Em solução aquosa 140
Em solução de água deuterada (D,0) 147
Uma visão integrada 150
1.2 Constantes de equilíbrio para o sistema Hg2+/glicilglicina 152
Por medição da área de sinais em espectros de H (variação do pH e das concentrações) 152
Por medição dos desvios químicos (variação do pH) 154
2. Citidina 158
2.1 Estudo das espécies em solução 159
2.2 Constantes de equilíbrio para o sistema Hg27citidina 166
3. O sistema ternário Hg(N0 ) / Citidina / Glicilglicina 174
3 2
3.1 Estudo das espécies em solução 174
4. Conclusão 175
IH Cálculo Teórico e Determinação Experimental
de Constantes de Relaxação Transversal em RMN 179
8 Cálculo teórico e determinação de constantes de tempo de relaxação transversal, T 181
2
1. Cálculo teórico de T 182
2
1.1 Método 182
1.2 Computação 185
1.3 Resultados 186
2. Medição de T para transições de quantum nulo e quantum duplo num sistema AX 188
2
2.1 Condições experimentais 192
2.2 Sequências de impulsos 192
2.3 TQN e 7QD para os núcleos H-5 (A) e H-6 (X) da citosina 196
2 2
Apêndice 199
Resumo 231
Résumé 232
Abstract 233
Bibliografia 235
Prefácio
A ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) é um método instru
mental privilegiado para o estudo de muitos processos dinâmicos que ocorrem em
solução. Devido à escala de tempo característica desta espectroscopia, que utiliza
frequências da ordem dos megahertz, é possível em muitos casos obter espectros
RMN que podem fornecer, directa ou indirectamente, informação sobre equilíbrio
químico, fenómenos de permuta, movimentação intramolecular e relaxação nuclear.
A criação, desenvolvimento e aplicação de técnicas de RMN para o estudo
destes fenómenos são actividades de investigação vastas e ainda em grande expan
são. Uma das áreas de particular interesse e dificuldade é a química biológica,
nomeadamente a bioinorgânica e a química das macromoléculas, assuntos em que as
técnicas instrumentais têm vindo a ganhar cada vez maior importância.
O estudo do papel dos catiões metálicos na matéria viva tem revelado a sua
importância fulcral para muitos processos bioquímicos essenciais, com funções regu
ladoras, estruturais ou coenzimáticas. Os catiões metálicos como cofactores enzimá
ticos encontram-se invariavelmente coordenados a proteínas, numa grande variedade
de geometrias, através dos aminoácidos das cadeias polipeptídicas ou de coenzimas
específicas. E portanto de grande interesse o estudo do equilíbrio de complexação
dos catiões metálicos com ligandos biológicos, nomeadamente com mistura de dife
rentes tipos de grupos coordenantes, tendo em vista o estabelecimento de modelos
para a sua actuação e considerando que a regulação da sua actividade está intima
mente relacionada com aspectos do equilíbrio de associação a esse tipo de ligandos.
A estereoespecificidade e a dinâmica intramolecular são também aspectos
essenciais para o funcionamento de macromoléculas como as proteínas enzimáticas
ou os ácidos nucléicos e o seu estudo em solução tem-se tornado cada vez mais
necessário para compreender certos aspectos do seu modo de funcionamento, uma
vez que a informação estrutural obtida através da técnica de difracção de raios X está
limitada ao estado sólido.
xii PREFÁCIO
Numa tentativa para contribuir para o estudo de alguns aspectos da química
biológica focados nos dois últimos parágrafos, e aproveitando as já referidas potencia
lidades da ressonância magnética nuclear para o estudo de processos dinâmicos em
solução, foi estudado no trabalho descrito nesta dissertação o equilíbrio de complexa-
ção de dois ligandos biológicos, citidina e glicilglicina, com os catiões bivalentes do
grupo 12 (Zn(II), Cd(II) e Hg(H)), metais com um papel relevante em química biológi
ca. Foram também desenvolvidos instrumentos teóricos e práticos para o estudo da
relaxação nuclear, tendo em vista a dependência daquele fenómeno da movimentação
molecular e a utilização dos parâmetros de relaxação (T e T ) para o seu estudo.
t 2
Esta dissertação está dividida em três Partes; na Parte I é esboçado o quadro de
referência teórico e são definidos os conceitos básicos para a compreensão e execu
ção do trabalho experimental. Esta Parte é constituída por três Capítulos dedicados à
descrição de alguns aspectos da química biológica dos catiões metálicos do grupo 12
(Capítulo 1), da espectroscopia de RMN (Capítulo 2), e da metodologia utilizada
para a determinação de constantes de equilíbrio por RMN (Capítulo 3).
Na Parte H, dividida em quatro Capítulos, é apresentado o estudo da formação
dos complexos binários e ternários mistos de citidina e glicilglicina com zinco(II),
cádmio(II) e mercúrio(II). No Capítulo 4 são discutidos aspectos relacionados com a
definição dos estados de referência, com a escolha do padrão de referência interna
para os desvios químicos e com a aplicabilidade dos métodos utilizados para o
cálculo das constantes de equilíbrio. Nos três Capítulos seguintes são apresentados
os resultados do cálculo das constantes de acidez dos ligandos referidos (Capítulo 5)
das constantes de estabilidade dos complexos formados com zinco(II) e cádmio(II)
(Capítulo 6), e das constantes de estabilidade dos complexos formados com mer-
cúrio(II), utilizando espectros de equilíbrio de cinética lenta e rápida na escala de
tempo de RMN (Capítulo 7).
Na Parte IH (Capítulo 8) é apresentado um método, e respectiva aplicação
computacional, para o cálculo de constantes de tempo de relaxação transversal, T ,
2
para um sistema com qualquer número de núcleos, e duas sequências de impulsos para
a determinação experimental dessas constantes para as transições de quantum duplo e
quantum nulo de um sistema de dois núcleos não acoplados ou fracamente acoplados.
Agradecimentos
À Junta Nacional de Investigação Científica e Tecnológica, a concessão de uma bolsa de estudo para
doutoramento no País.
Ao Grupo de Química da Faculdade de Ciências do Porto, por me ter aceite como estudante de
Doutoramento.
Ao Dr. Baltazar de Castro, a proposta de um tema de doutoramento da minha predilecção, e o seu
apoio e orientação constantes.
To Dr. Timothy J. Norwood, its patience and generosity for trying to teach a mere biochemist the most
esotheric aspects of NMR spectroscopy.
A Sandra Moura e Paula Gameiro, a sua imprescindível ajuda durante a realização deste trabalho.
A Natália Cordeiro, Alexandre Magalhães e Vitor Morais, a resolução dos meus mais variados
problemas de entendimento com o UNIX.
Ao Professor Doutor Ferreira Gomes, os comentários a alguns trechos desta dissertação.
Aos Professores Doutores Carlos Corrêa, Conceição Rangel e Cristina Freire, a sua ajuda incondicio
nal nos mais variados aspectos logísticos.
A João, Mário, Fernando, Lígia, Amélia, Arménio e outros Amigos que, com a sua boa disposição,
contribuíram decisivamente para a manutenção da minha saúde mental.
A Ana e à Eva, por me terem aturado
Aos meus Pais, a quem devo tudo