Análise integrativa de perfis transcricionais de pacientes com diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e

192 Pages·2012·5.8 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

ADRIANE FEIJÓ EVANGELISTA

Análise integrativa de perfis transcricionais de pacientes com diabetes mellitus
tipo 1, tipo 2 e gestacional, comparando-os com manifestações demográficas,
clínicas, laboratoriais, fisiopatológicas e terapêuticas

Ribeirão Preto – 2012
ADRIANE FEIJÓ EVANGELISTA

Análise integrativa de perfis transcricionais de pacientes com diabetes mellitus tipo 1, tipo 2
e gestacional, comparando-os com manifestações demográficas, clínicas, laboratoriais,
fisiopatológicas e terapêuticas

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Genética
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Antonio Donadi
Co-orientador: Prof. Dr. Geraldo A. S. Passos

Ribeirão Preto – 2012
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Evangelista, Adriane Feijó

Análise integrativa de perfis transcricionais de pacientes com diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e
gestacional, comparando-os com manifestações demográficas, clínicas, laboratoriais, fisiopatológicas
e terapêuticas.
Ribeirão Preto, 2012
192p.

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo.
Área de Concentração: Genética.
Orientador: Donadi, Eduardo Antonio
Co-orientador: Passos, Geraldo A.

1. Expressão gênica – microarrays 2. Análise bioinformática por module maps
3. Diabetes mellitus tipo 1 4. Diabetes mellitus tipo 2 5. Diabetes mellitus gestacional
FOLHA DE APROVAÇÃO

ADRIANE FEIJÓ EVANGELISTA
Análise integrativa de perfis transcricionais de pacientes com diabetes mellitus tipo 1, tipo 2 e
gestacional, comparando-os com manifestações demográficas, clínicas, laboratoriais,
fisiopatológicas e terapêuticas.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Genética

Aprovado em:

Banca Examinadora
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição:_______________________Assinatura:_____________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição:_______________________Assinatura:_____________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição:_______________________Assinatura:_____________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição:_______________________Assinatura:_____________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________________
Instituição:_______________________Assinatura:_____________________________
Dedico especialmente este trabalho

Aos meus pais Laercio e Rita
Ao meu irmão Renato
Ao meu namorado Eduardo
AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Dr. Eduardo Antonio Donadi pela oportunidade de participar do seu
grupo de pesquisa, pelo apoio científico e pessoal, pelo exemplo a ser seguido.
Ao meu co-orientador no Brasil Prof. Dr. Geraldo Aleixo da Silva Passos Jr. e ao meu
supervisor estrangeiro na França Prof. Dr. Denis Puthier pela imensa contribuição neste
trabalho, e pela formação científica.
Aos pesquisadores participante do projeto temático FAPESP, ao qual este trabalho está
inserido. A Prof. Dra. Elza Tiemi Sakamoto-Hojo, pela contribuição científica e correção do
manuscrito para publicação. Ao prof. Dr. Milton Cesar Foss e à prof. Dra. Maria Cristina
Foss-Freitas pela orientação clínica e seleção dos pacientes. À Dra. Diane Meyre Rassi pela
participação na etapa da seleção e coleta das amostras.
À equipe francesa. À Prof. Dra. Catherine Nguyen, diretora da unidade INSERM-U928, pelo
apoio e autorização da utilização das dependências e treinamento. Ao Prof. Dr. Pascal Rihet
pelas discussões e sugestões de análises, de grande valia neste trabalho. Aos Prof. Dr. Carl
Hermann e Prof. Dr. Sammuel Granjeau pelas sugestões e ensinamentos em programação em
linguagens R e PERL. Aos técnicos Hèlène Holota, Bèatrice Loriod e, em especial, à
Gènèvieve Victorero por todos os ensinamentos.
A divisão de endocrinologia do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, em cujas dependências foram obtidas as amostras. Ao laboratório de HLA do
Hemocentro da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, em especial à técnica Neife
Deghaide. A todos os funcionários que direta ou indiretamente contribuíram na realização
deste trabalho. Aos pacientes, sem os quais esse trabalho não poderia ser realizado.
Ao Laboratório de Imunogenética Molecular do Departamento de Genética da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto (FMRP/USP). Agradeço aos colegas Danilo Xavier, Cristhianna
Collares, Renata Almeida, Paula Takahashi, Fernanda Manoel-Caetano, Thais Arns, Natália
Joanne, Amanda Assis, Flávia Porto, Juliana Massaro, Ernna Domingues, Claudia Macedo,
Thais Fornari, Paula Donate, Janaina Dernowsek e Nicole Pezzi. Aos colegas que
contribuíram com a minha formação desde o mestrado: Cristina Junta e Márcia Marques.
Ao programa de Pós-graduação em Genética, do Departamento de Genética da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto – USP. Agradeço aos professores pela qualidade da formação e
aos colegas de pós-graduação. Agradeço à secretaria do departamento, em especial às
secretárias Susie, Silvia e Maria Aparecida pela eficiência e ajuda todos esses anos.
Ao CNPq FAPESP, e FAEPA pelo apoio financeiro necessário para a realização deste
trabalho.
Aos membros da banca examinadora pela prontidão, contribuições, críticas e sugestões.
Aos meus queridos amigos Ana Durvalina Bomtorin, Breno Mello, Ana Rita Batistela e
Andressa Morales pelo companheirismo. Aos amigos da França, Miriam Yammine, Elise
Yammine, Alberto Marcus, Joanna Bou Saab, Daou Pascale, Sabrina Sanfilippo, Yuska
Aguiar e Luciana Lopes pelas discussões científicas e pelos grandes momentos vividos.
Aos meus pais Laércio e Rita pelo exemplo de vida e superação. A toda minha família que
sempre me apoiou. Ao meu namorado Carlos Eduardo Silva Lazzarini, e à sua família, pelo
companheirismo, paciência e incentivo de extrema importância no período de realização deste
trabalho, e em todos os momentos.
RESUMO

Evangelista, A. F. Análise integrativa de perfis transcricionais de pacientes com diabetes
mellitus tipo 1, tipo 2 e gestacional, comparando-os com manifestações demográficas,
clínicas, laboratoriais, fisiopatológicas e terapêuticas. 2012. 192p. Tese (Doutorado) –
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 2012.
O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) tem etiologia autoimune, enquanto o diabetes mellitus tipo 2
(DM2) e o diabetes mellitus gestacional (DMG) são considerados como distúrbios
metabólicos. Neste trabalho, foi realizada análise do transcriptoma das células mononucleares
do sangue periférico (do inglês, peripheral mononuclear blood cells - PBMCs), obtidas de
pacientes com DM1, DM2 e DMG, realizando análises por module maps a fim de comparar
características patogênicas e aspectos gerais do tratamento com anotações disponíveis de
genes modulados, tais como: a) análises disponíveis a partir de estudos de associação em larga
escala (do inglês genome-wide association studies – GWAS); b) genes associados ao diabetes
em estudos clássicos de ligação disponíveis em bancos de dados públicos; c) perfis de
expressão de células imunológicas fornecidos pelo grupo ImmGen (Immunological Project).
Foram feitos microarrays do transcriptoma total da plataforma Agilent (Whole genome one-
color Agilent 4x44k) para 56 pacientes (19 DM1, 20 DM2 e 17 DMG). Para a compreensão
dos resultados foram aplicados filtros não-informativos e as listas de genes diferencialmente
expressos foram obtidas por análise de partição e análise estatística não-paramétrica (rank
products), respectivamente. Posteriormente, análises de enriquecimento funcional foram feitas
pelo DAVID e os module maps construídos usando a ferramenta Genomica. As análises
funcionais contribuíram para discriminar os pacientes a partir de genes envolvidos na
inflamação, em especial DM1 e DMG. Os module maps de genes diferencialmente expressos
revelaram: a) genes modulados exibiram perfis de transcrição típicos de macrófagos e células
dendríticas, b) genes modulados foram associados com genes previamente descritos como
genes de complicação ao diabetes a partir de estudos de ligação e de meta-análises; c) a
duração da doença, obesidade, número de gestações, níveis de glicose sérica e uso de
medicações, tais como metformina, influenciaram a expressão gênica em pelo menos um tipo
de diabetes. Esse é o primeiro estudo de module maps mostrando a influência de padrões
epidemiológicos, clínicos, laboratoriais, imunopatogênicos e de tratamento na modulação dos
perfis transcricionais em pacientes com os três tipos clássicos de diabetes: DM1, DM2 e
DMG.
Palavras-chave: Expressão gênica, microarrays, bioinformática, module maps, diabetes
mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus gestacional.
ABSTRACT

Evangelista, A. F. Integrative analysis of transcriptional profiles in type 1, type 2 and
gestational diabetes mellitus, compared with demographic, clinical, laboratory,
physiopathology and therapeutic manifestations. 2012. 192p. Thesis (PhD Degree) –
Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Brazil, 2012.
Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease while type 2 (T2D) and gestational diabetes
(GDM) are considered as metabolic disturbances. We performed a transcriptome analysis of
peripheral mononuclear blood cells obtained from T1D, T2D and GDM patients, and we took
advantage of the module map approach to compare pathogenic and treatment features of our
patient series with available annotation of modulated genes from i) genome-wide association
studies; ii) genes provided by diabetes meta-analysis in public databases, iii) immune cell
gene expression profiles provided by the ImmGen project. Whole genome one-color Agilent
4x44k microarray was performed for 56 (19 T1D, 20 T2D, 17 GDM) patients. Non-
informative filtered and differentially expressed genes were obtained by partitioning and rank
product analysis, respectively. Functional analyses were carried out using the DAVID
software and module maps were constructed using the Genomica tool. Functional analyses
contributed to discriminate patients on the basis of genes involved in inflammation, primarily
for T1D and GDM. Module maps of differentially expressed genes revealed that: i) modulated
genes exhibited transcription profiles typical of macrophage and dendritic cells, ii) modulated
genes were associated with previously reported diabetes complication genes disclosed by
association and meta-analysis studies, iii) disease duration, obesity, number of gestations,
glucose serum levels and the use of medications, such as metformin, influenced gene
expression profiles in at least one type of diabetes. This is the first module map study to show
the influence of epidemiological, clinical, laboratory, immunopathogenic and treatment
features on the modulation of the transcription profiles of T1D, T2D and GDM patients.
Palavras-chave: Gene expression – microarrays, bioinformatic analysis by module maps,
type 1 diabetes mellitus, type 2 diabetes mellitus, gestational diabetes mellitus.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Gráfico representativo dos eventos associados com a perda da massa de células beta
pancreáticas ao longo do tempo devido à mecanismos autoimunes no DM 1. Adaptado de
(EISENBARTH, GEORGE S; JEFFREY, 2008) ..................................................................................25
Figura 2. Valor preditivo e datas da identificação dos locos de susceptibilidade ao DM1. Adaptado de
(POCIOT et al., 2010). ...........................................................................................................................28
Figura 3. Valor preditivo e datas da identificação dos alelos de susceptibilidade ao DM2. Adaptado
PROKOPENKO (2008). ........................................................................................................................34
Figura 4. Distribuição de alelos de risco previamente associados ao DM2 em indivíduos com
intolerância à glicose e no DMG. O efeito do risco é aumentado pela combinação de 11 genes
principais. Adaptado de LAUENBORG (2009). ....................................................................................41
Figura 5. Heatmap representativo das variáveis demográficas, clínicas, laboratoriais e terapêuticas
utilizadas nas análises bioinformáticas deste trabalho. ..........................................................................53
Figura 6. Esquema representativo das reações de transcrição reversa, amplificação, purificação e
hibridação de microarrays da plataforma Agilent. Adaptado de (“G4140-
90040_GeneExpression_One-color_v6.5.pdf (objeto application/pdf)”, [S.d.])....................................58
Figura 7. Pipeline representativo da análise integrativa dos perfis transcricionais com variáveis
demográficas, clínicas, laboratoriais e terapêuticas, usando a estratégia de module maps. Em A) Genes
filtrados por fold change são selecionados quanto à sua representatividade nos gene sets; B) Genes
identificados nas categorias fornecidas do gene set são separados em módulos de expressão; C) Os
módulos são re-agrupados; D) Os módulos significativos são finalmente comparados com os array
sets, gerando os heatmaps finais. Adaptado de (SEGAL et al., 2004). ..................................................63
Figura 8. Parâmetros utilizados na análise de module maps. .................................................................64
Figura 9. Distribuição das frequências dos dados contra os valores de expressão em escala logarítmica
em uma lâmina de microarray Agilent. Encontram-se destacados os valores de background e o valor de
corte utilizado para filtragem. ................................................................................................................72
Figura 10. Gráficos boxplot de todos os dados de microarrays utilizados neste trabalho, após a
normalização pela metodologia quantile. ...............................................................................................73
Figura 11. Gráficos MA plots de todos os microarrays utilizados neste trabalho. Encontram-se
representadas a razão da intensidade de sinal de cada microarray na abcissa e a intensidade de sinal
gerada pela mediana dos sinais de todos os microarrays na ordenada. .................................................74
Figura 12. Agrupamento hierárquico da correlação de Pearson dos 19 agrupamentos de genes
corregulados identificados pela análise de partição DBF-MCL. Encontra-se em destaque o
agrupamento 12 ......................................................................................................................................76