Table Of ContentNina Stemmer
Alzheimer-Krankheit:
Bindepartner und Prozessierung
des Amyloid Precursor Proteins
2008
Biochemie
Alzheimer-Krankheit:
Bindepartner und Prozessierung
des Amyloid Precursor Proteins
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften im Fachbereich Chemie
der Universit¨at Bielefeld
vorgelegt von
Nina Stemmer
aus Gu¨tersloh
- Bielefeld/Hamburg · Mai 2008 -
Universit¨at Hamburg
Zentrum fu¨r Molekulare Neurobiologie Hamburg
Institut fu¨r die Biosythese von neuralen Strukturen
Prof. Dr. M. Schachner
Falkenried 94
D-20251 Hamburg
Universit¨at Bielefeld
Fakult¨at fu¨r Chemie
Biochemie II
Prof. Dr. J. Frey
Universitattsstr. 25
D-33615 Bielefeld
Betreuer/1. Gutachter : Prof’in Dr. M. Schachner
Prof. Dr. J. Frey
2. Gutachter : Prof’in Dr. G. Fischer von Mollard
Tag der mu¨ndlichen Pru¨fung : 07.07.2008
IN GEDENKEN AN KAI
Erkl¨arung
Hiermit versichere ich, die vorliegende Arbeit selbst¨andig und ohne fremde Hilfe angefertigt
zu haben. Die verwendete Literatur und sonstige Hilfsmittel sind vollst¨andig angegeben.
Hamburg, Mai 2008
Inhaltsverzeichnis
Deckblatt I
Erkl¨arung VII
Inhaltsverzeichnis XIII
Kurzfassung XV
Abstract XVII
1 Einleitung 1
1.1 Die Alzheimer-Krankheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Amyloid Plaques und Aβ Toxizit¨at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Das Zelladh¨asionsmoleku¨l APP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.4 Prozessierung von APP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.4.1 Der nicht-amyloidogene Weg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.4.2 Der amyloidogene Weg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.5 Mutationen des Amyloid Precursor Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.6 β-Sekretase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.7 γ-Sekretase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.7.1 Presenilin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.7.2 Nicastrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.7.3 Aph-1 und Pen-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.8 Das Zelladh¨asionsmoleku¨l L1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.9 APP-Bindepartner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.9.1 Kreatinkinase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.9.2 Calretikulin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.10 Proteasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.10.1 Metzinkine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.10.1.1 ADAMs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.10.1.2 MMPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.11 Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2 Material 29
2.1 Allgemeine Chemikalien und Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.2 Reaktionskits und Enzyme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.3 Antibiotika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.4 Detergenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.5 Inhibitoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.6 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.7 Basiszelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.8 Stabil transfizierte Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
IX
Inhaltsverzeichnis
2.9 Kultivierung und Langzeitlagerung von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.9.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.9.2 Langzeitlagerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.10 E.coli-St¨amme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.10.1 Stammhaltung und Kultivierung von E.coli . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.10.1.1 Stammhaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.10.1.2 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.11 Vektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.12 Expressionskonstrukte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.13 Antik¨orper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.13.1 Prim¨arantik¨orper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.13.2 Sekund¨arantik¨orper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.14 Metalloproteasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.15 Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.16 GST-Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.17 Molekulargewicht-Standards . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.18 H¨aufig verwendete L¨osungen und Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3 Methoden 46
3.1 Biochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.1.1 Eindimensionale SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) . . . . 46
3.1.2 Trizin-SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.1.3 Zymographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.1.4 SDS-Gelf¨arbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.1.4.1 Coomassie-F¨arbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.1.4.2 Silberf¨arbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.1.5 Immunoblot-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.1.5.1 ElektrophoretischerTransfervonProteinenaufNitrocellulose-
Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.1.5.2 Immunreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.1.5.3 ECL-Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.1.6 Proteinf¨allung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.1.6.1 Proteinf¨allung nach Wessel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.1.6.2 Acetonf¨allung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.1.7 Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration (BCA-Test) . . . . . . . 55
3.1.8 Zellfraktionierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.1.8.1 Herstellung eines Mausgehirn-Homogenates . . . . . . . . . . 56
3.1.8.2 Herstellung der l¨oslichen Fraktion S1 und des 17000 ∗ g“ -
”
Sedimentes3 aus Mausgehirn-Homogenat . . . . . . . . . . . 57
3.1.8.3 Isolierung von Fraktionen, angereichert mit Synaptosomen,
Myelin, Axolemma und Mitochondrien . . . . . . . . . . . . 57
3.1.9 L¨osen von Membranbestandteilen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.1.10 Aufreinigung des anti-D-Antik¨orpers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.1.10.1 Isolierung des anti-D-IgG mit Hilfe des DEAE Kit (Bio-Rad) 60
3.1.10.2 Isolierung des anti-D-IgG durch Protein A . . . . . . . . . . 61
3.1.11 Konzentration einer Probe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.1.12 Herstellung einer S¨aule fu¨r die Affinit¨atschromatographie . . . . . . . 62
3.1.12.1 Kopplung des anti-D IgG an die Matrix einer CarboLink S¨aule 62
3.1.12.2 Kopplung des anti-D-IgG an CNBr-aktivierte Sepharose-4B . 63
X
Description:Die Proteolyse von APP erfolgt zu 90% auf dem nicht-amyloidogenen Weg durch die α- und die γ-Sekretase, Durchführung Um die Affinitätschromatographie (System Controller und Pumpe, Econo, 2006) bindet VDAC (voltage-dependent anion channel)-vermittelt an die äußere Mitochon-.
