Alterações metabólicas e o papel da mitocôndria no processo de tumorigênese de astrocitomas ...

136 Pages·2010·9.67 MB·Portuguese

Renata de Luizi Correia

Alterações metabólicas e o papel da
mitocôndria no processo de
tumorigênese de astrocitomas
humanos

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Doutor em Ciências

Área de concentração: Neurologia
Orientadores: Suely Kazue Nagahashi Marie
Sueli Mieko Oba-Shinjo

São Paulo
2010
ii

Renata de Luizi Correia

Alterações metabólicas e o papel da
mitocôndria no processo de
tumorigênese de astrocitomas
humanos

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Doutor em Ciências

Área de concentração: Neurologia
Orientadores: Suely Kazue Nagahashi Marie
Sueli Mieko Oba-Shinjo

São Paulo
2010
iii

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

C o r reia, Renata de Luizi
Alterações metabólicas e o pap el da mitocôndria no processo de tumorigênese
de astrocitomas humanos / Renata de Luizi Correia. -- São Paulo, 2010.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Departamento de Neurologia.
Área de concentração: Neurologia.

Orientadora: Suely Kazue Nagahashi Marie
Co-orientadora: Sueli Mieko Oba -Shinjo.

Descritores: 1.Astrocitoma 2 .DNA mitocondrial 3.Fatores de transcrição
mitocondrial 4.TFAM 5.POLG 6.Sobrevida

USP/FM/SBD-086/10
iv

Aos verdadeiros caminhos de sabedoria e
ascensão percorridos
v

Agradecimentos

À minha família, pelo amor e apoio profissional imprescindíveis para
meu contínuo caminho na ciência, educação e construção do saber.

À Profa. Dra. Suely K N Marie, pelos ensinamentos – não só
científicos, mas em todas as esferas do conhecimento – meu muito obrigada
pelas lições de vida, conduta e moral.

À Dra. Sueli M Oba-Shinjo, co-orientadora afetuosa e sábia, por
instruir-me, em diversos sentidos, durante o desenvolvimento desta tese.

À Roseli da Silva, por ter me resgatado à ciência, pela amizade e,
principalmente, por transformar a dureza da rotina em extroversão.

À guru Miyuki Uno, pela seriedade e companheirismo ímpar ao longo
da minha evolução.

A todos os colegas do laboratório LIM15, que colaboraram direta ou
indiretamente com a elaboração deste trabalho; em especial, à prontidão de
Célia Miyagui, à descontração e carinho de Loira (Mussya), Mazé, Priscila e
Simone (Bassora-Urso).

Aos colegas e médicos do ambulatório Dr. Flávio Miura, Tatiana
Bukstein, Dona Dirce, Pedro Augusto (in memoriam), Fernanda P Guimarães
e André Bianco, pela compaixão desprendida durante os atendimentos.

Aos Professores Dr. João Oliveira Bosco e Dr. Francisco Laurindo,
pela condução e fosforilações pertinentes.

Ao Prof. Dr. Antônio Sesso, à Dra. Maria de Lourdes Higuchi, à Joyce
Tiyeko Kawakami, à Karina Funabashi, à Júlia La Chioma Silvestre, à Fátima
Curto e à Meire Pereira, por tornarem possível a realização dos
experimentos em microscopia eletrônica.

Aos karatecas, guerreiros amigos, por me tornarem mais forte e alerta
nesta luta diária.

A todos do Espaço Educacional, pela compreensão e afetuosa
convivência.

Aos funcionários da pós-graduação pelo suporte administrativo,
durante todo o andamento deste trabalho – em especial à atenção de
Elisabeth Laurentano.

Ao CNPq, pelos proventos fornecidos durante a viabilização da tese.
vi

SUMÁRIO

Lista de tabelas ............................................................................................ ix
Lista de figuras ........................................................................................... xi
Lista de abreviaturas ................................................................................. xiii
Resumo ....................................................................................................... xvi
Summary ................................................................................................... xvii

Introdução ..................................................................................................... 1
1. Bioenergética...................................................................................... 1
1.1 Glicose aeróbica e anaeróbica ................................................. 2
1.2 Ciclo do ácido tricarboxílico ou do ácido cítrico ....................... 3
2. Mitocôndria ......................................................................................... 6
2.1 Transporte de elétrons e fosforilação oxidativa ........................ 8
2.2 DNA mitocondrial e doenças .................................................. 10
2.3 Replicação e transcrição mitocondrial .................................... 15
3. Efeito Walburg e alterações matabólicas mitocondriais ................... 19
4. Tumores do sistema nervoso central ................................................ 21

Objetivos ..................................................................................................... 24

Métodos ....................................................................................................... 26
1. Casuística ......................................................................................... 28
2. Análise de expressão gênica por microarray e seleção dos
genes .................................................................................................... 29
3. Extração de DNA .............................................................................. 27
4. Extração de RNA total ...................................................................... 28
5. Síntese de DNA complementar por transcrição reversa ................... 28
6. Quantificação do número de cópias de DNAmt ................................ 29
vii

6.1 Absoluta ................................................................................. 29
6.1.1 Clonagem do DNA mitocondrial ................................. 30
6.2 Relativa .................................................................................. 31
7. Quantificação do número de mitocôndrias ....................................... 32
8. Análise da expressão por PCR em Tempo Real (QT-PCR) ............. 34
9. Análise estatística ............................................................................. 38

Resultados................................................................................................... 39
1. Seleção dos genes através dos dados prévios de
microarray ............................................................................................ 39
2. Validação dos genes implicados na via metabólica
energética ............................................................................................. 44
3. Análise do número de cópias de DNAmt .......................................... 48
4. Morfometria mitocondrial .................................................................. 51
5. Expressão relativa dos fatores de transcrição e polimerase
mitocondriais ........................................................................................ 56
6. Análise da sobrevida global .............................................................. 60

Discussão .................................................................................................... 65
Análise das vias metabólicas, glicólise, ciclo do ácido cítrico e
fosforolação oxidativa ........................................................................... 66
Expressão dos genes relacionados ao ciclo dos ácidos
tricarboxílicos........................................................................................ 70
Expressão dos genes relacionados à fosforilação oxidativa ................ 71
Mitocôndria e câncer ............................................................................ 72
Número de cópias do DNAmt ............................................................... 73
Número de organelas mitocondriais ..................................................... 73
Morfologia mitocondrial ........................................................................ 74
Fatores de replicação e transcrição mitocondriais ................................ 75
viii

Conclusões.................................................................................................. 79
Anexos ......................................................................................................... 80
Referências................................................................................................ 108
ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Produtos de genes de codificação mitocondrial e
nuclear envolvidos na fosforilação oxidativa .......................................... 9
Tabela 2 – Classificação dos astrocitomas ................................................... 21
Tabela 3 – Casuística do projeto .................................................................. 26
Tabela 4 – Cálculos para obtenção da curva padrão
do DNA plasmidial ................................................................................ 31
Tabela 5 – Equivalência de um ponto (+) em mm² ....................................... 34
Tabela 6 – Sequências e concentrações dos pares de
primers para PCR em tempo real, tamanho dos
produtos e eficiências de amplificação ................................................. 37
Tabela 7 – Subunidades dos complexos da fosforilação
oxidativa e expressão relativa dos genes ............................................. 42
Tabela 8 – Enzima, gene codificador e expressão relativa
em GBMs dos genes selecionados da via glicolítica,
ciclo dos ácidos tricarboxílicos e fosforilação oxidativa ........................ 43
Tabela 9 – Valores de média e mediana do número de cópias
relativo de DNAmt nos astrocitomas de diferentes
graus de malignidade e tecido cerebral não tumoral ............................ 49
Tabela 10 – Morfometria mitocondrial de dois casos de GBM ...................... 54
Tabela 11 – Expressão relativa de TFAM, TFB1M, TFB2M e
POLG em GBM .................................................................................... 56
Tabela 12 – Valores de média, mediana das expressões
relativas dos genes TFAM, TFB1M, TFB2M e
POLG em astrocitomas de diferentes graus de
malignidade e tecido cerebral não tumoral ........................................... 58
x

Tabela 13 – Correlação de sperman dos valores de
expressão relativa em astrocitomas dos genes
TFAM, TFB1M, TFB2M e POLG e número de cópias
do DNAmt ............................................................................................. 59
Tabela 14 – Análise do risco relativo da coexpressão
de TFAM e POLG ................................................................................. 63
Tabela 15 – Valores de p entre os grupos tanto para a
análise do número de cópias de DNAmt como para a
expressão relativa de TFAM ................................................................. 64