119.Determinacion de la presencia de enfermedades de alto riesgo en poblaciones de peces

268 Pages·2011·29.44 MB·Spanish

I N S T I T U T O D E F O M E N T O P E S Q U E R O

INFORME FINAL
CONVENIO SUBPESCA: Asesoría Integral para la toma de decisiones en pesca y acuicultura, 2010
Determinación de la presencia de
enfermedades de alto riesgo en
poblaciones de peces silvestres
SUBPESCA / Agosto 2011

Requierente
Subsecretaría de Pesca

Subsecretario de Pesca
Pablo Galilea Carrillo

Ejecutor
Instituto de Fomento Pesquero

Director Ejecutivo
Jorge Toro Da’ Ponte

Jefe de División Investigación en Acuicultura
Leonardo Guzmán Méndez

Jefe de Proyecto
Sergio Contreras Lynch

Autores
Paula Miranda
Verónica Matus
Tadaishi Yatade
Sergio Contreras
Juan Carlos Quintanilla
Margarita González
INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO / DIVISIÓN INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA

RESUMEN EJECUTIVO

El crecimiento de la industria salmonera en los últimos años ha estado acompañado de la
presentación de enfermedades de carácter emergente que han afectado directamente el estatus
sanitario nacional, entre ellas se encuentran la Vibriosis, Estreptococosis, Furunculosis atípica y
durante el último tiempo, la Anemia Infecciosa del Salmón, cuyo primer brote fue reportado
oficialmente el 25 de julio de 2007 (SERNAPESCA)

A nivel internacional, países con sectores acuicultores de importancia han desarrollado numerosas
investigaciones a objeto de poder determinar el riesgo de transmisión horizontal de enfermedades
entre peces cultivados, peces de cultivo escapados y otros peces silvestres. Por otro lado, los
métodos moleculares se han transformado en importantes herramientas en el diagnóstico y el
estudio de la diversidad, mantenimiento y diseminación de agentes patógenos, encontrándose
actualmente descritas las técnicas de Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR) convencional, para
todos los patógenos presentes en la lista 1 de enfermedades de alto riesgo (EAR), así como del
virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAv), Vibrio ordalii, Piscirickettsia salmonis y Aeromonas
salmonicida atípica.

En Chile existe escasa información respecto al estatus sanitario de las poblaciones silvestres, como
a su vez, la posible transmisión horizontal de agentes patógenos entre las poblaciones
silvestres/asilvestradas y de cultivo.

El presente documento constituye el Informe final del proyecto “Determinación de la presencia de
enfermedades de alto riesgo en poblaciones de peces silvestres” cuyo objetivo general fue
determinar y cuantificar la presencia de agentes causales de enfermedades de alto riesgo en
poblaciones de peces silvestres y asilvestrados de las regiones de Los Lagos y Aysén.

Las principales actividades ejecutadas consistieron en la realización de los muestreos de especies
silvestres y asilvestradas para las Agrupaciones de Concesiones de Salmonicultura (ACS) 1, 10, 17,
18 y 28. Las muestras resultantes fueron analizadas por PCR convencional y tiempo real, para los
patógenos Vibrio ordalii, Aeromonas salmonicida atípica, P.salmonis, Eubacterias, Virus de la
septicemia Hemorrágica viral (VHSV), Virus de la necrosis hematopoyética epizoótica (EHNV), Virus
de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), Virus del Oncorhynchus Massou (OMV), Virus de
la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAV) y Alfavirus, en forma semicuantitativa, utilizando genes
reporteros para las especies capturadas. Los resultados finales indican que sólo se registró
positividad para P. salmonis con 51 muestras positivas de un total de 796 muestras analizadas.

Las muestras analizadas fueron secuenciadas entregando un alto porcentaje de identidad con P.
salmonis. Las secuencias dominantes en las poblaciones silvestres corresponden a la cepa
Irlandesa IRE99-D.
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Por otro lado se realizó un estudio de factores de riesgo, identificando a las ACS N° 1 y 17, como las
que presentan mayor probabilidad de diagnósticos positivos de peces silvestres para el agente
patógeno asociado a factores del área. Con los antecedentes de los diagnósticos, información
sanitaria de los centros de cultivo y las ACS, se ejecutó un análisis de riesgo que identificó que la
presencia de P. salmonis en las poblaciones silvestres tiene un bajo impacto sobre las poblaciones
de peces en cultivo. Sin embargo, se hace necesario el dilucidar información objetiva respecto a las
probabilidades de transmisión de enfermedades entre las poblaciones silvestres/cultivo para que el
análisis de riesgo tenga sustento empírico. Dada la falta de información disponible, los resultados del
análisis de riesgo se basan en la evaluación subjetiva de la probabilidad otorgada por el panel de
expertos conformado para este proyecto.

Finalmente se diseñó un Programa de Vigilancia para el monitoreo de Enfermedades de peces
silvestres y asilvestrados, y se identificaron medidas de mitigación de riesgo en el caso de
presentarse una condición sanitaria adversa en las poblaciones silvestres, eventualmente
transmisible a las poblaciones de cultivo, y considerando como objetivo central, la disminución de la
población susceptible.

En consecuencia, y a la luz de los antecedentes científicos revisados para el presente informe, se
considera de alta relevancia el desarrollar un programa estable de Vigilancia de enfermedades y
patógenos en peces silvestres/asilvestrados como parte de la vigilancia integral de los sistemas
acuáticos vinculados a la actividad acuicultora, dada su eventual relevancia en la emergencia de
enfermedades.

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ÍNDICE GENERAL

Página

RESUMEN EJECUTIVO ............................................................................................................. i
ÍNDICE GENERAL ..................................................................................................................... iii
INDICE DE ANEXOS .................................................................................................................. v
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................. vi
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................................. viii

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 3

2.1 Objetivo general………………………………………………… .......................... …… 3
2.2 Objetivos específicos……………………………………………… ............................. 3

3. METODOLOGÍA ............................................................................................................ 4

3.1 Obtención de Muestras ........................................................................................ 4
3.2 Análisis de las muestras ....................................................................................... 4
3.3 Análisis estadístico de los resultados ................................................................... 8
3.4 Organización de la información y elaboración de matriz de riesgo ...................... 9
3.5 Conformación de Panel de expertos ad-hoc multidisciplinario ............................. 9
3.6 Diseño y Aplicación de encuesta.......................................................................... 9
3.7 Análisis de riesgo de la transmisión de EAR entre peces
asilvestrados/silvestres/cultivo ............................................................................. 10
3.8 Georeferenciar los resultados derivados del análisis de riesgo ............................ 14
3.9 Validación de sistema de vigilancia/monitoreo propuesto en el proyecto ............. 14
3.10 Diseño de propuesta de Vigilancia/monitoreo ...................................................... 15
3.11 Identificación de puntos críticos por zona ............................................................ 15
3.12 Diseño de propuesta de medidas de mitigación ................................................... 15

4. RESULTADOS .............................................................................................................. 16

4.1. Obtención de Muestras ........................................................................................ 16
4.2. Análisis de las Muestras ...................................................................................... 31
4.2.1. Solicitud e Ingreso de Controles Positivos EAR lista 1 ..................................... 31
4.2.2 Revisión Bibliográfica y elaboración de protocolos ........................................... 31
4.2.3 Búsqueda de posible gen reportero .................................................................. 32
4.2.4 Búsqueda de posible gen reportero universal.................................................... 32
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4.3. Elaboración, implementación y establecimiento de Protocolos de PCR y
extracción de Ácidos Nucleicos......................................................................... ... 35
4.4. Preparación de controles positivos ...................................................................... 37
4.5. PCR en base a protocolos finales ........................................................................ 42
4.6. Análisis de las muestras por PCR ....................................................................... 43
4.7. Cuantificación relativa de los resultados positivos ............................................... 48
4.8. Aislamiento viral de los positivos ......................................................................... 50
4.9. Análisis estadístico .............................................................................................. 51
4.10. Organización de la información y elaboración de matriz de interacción de
variables en base a estadística multivariada ....................................................... 53
4.11. Análisis de factores de riesgo de positividad a P. salmonis .............................. 56
4.12. Análisis de factores de riesgo de la prevalencia de pooles positivos a
Piscirickettsia salmonis de peces capturados en torno a centros de
cultivo............ ....................................................................................................... 59
4.13. Conformación del panel de expertos ..................................................................... 60
4.14. Diseño y aplicación de encuesta ........................................................................... 61
4.15. Análisis de Riesgo de la transmisión de EAR entre peces
asilvestrados/silvestres/cultivo ............................................................................. 61

4.16. Zonificación de las áreas estudiadas...................................................................... 73
4.17. Validación de sistema de vigilancia propuesto en el proyecto................................ 75
4.18. Diseño de propuesta de vigilancia/monitoreo......................................................... 84
4.19. Identificación de Puntos Críticos por Zona............................................................. 88
4.20. Diseño de propuesta de medidas de mitigación..................................................... 88

5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 90

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 95

ANEXOS
ANEXO 1. Fotografías Pesca de Investigación y procesamiento de Muestras
ANEXO 2. Certificados de eliminación de material biológico
ANEXO 3. Certificados de Ingreso de Controles positivos
ANEXO 4. Protocolos Finales LBM-IFOP
ANEXO 5. Respaldos Fotográficos de implementación de protocolos de PCR LBM-IFOP
ANEXO 6. Planilla de resultados muestras por Zona de muestreo
ANEXO 7. Resultados de las secuencias de P. salmonis por especie y porcentaje de
identidad.
ANEXO 8. Resultados de Alineamiento en BLAST
ANEXO 9. Encuestas sanitarias
ANEXO 10. Árboles de decisión de Análisis de Riesgo y Encuesta aplicada a Panel de
expertos.
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ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO 1. Fotografías Pesca de Investigación y procesamiento de Muestras
ANEXO 2. Certificados de eliminación de material biológico
ANEXO 3. Certificados de Ingreso de Controles positivos
ANEXO 4. Protocolos Finales LBM-IFOP
ANEXO 5. Respaldos Fotográficos de implementación de protocolos de PCR LBM-IFOP
ANEXO 6. Planilla de resultados muestras por Zona de muestreo
ANEXO 7. Resultados de las secuencias de P. salmonis por especie y porcentaje de identidad.
ANEXO 8. Resultados de Alineamiento en BLAST
ANEXO 9. Encuestas sanitarias
ANEXO 10. Árboles de decisión de Análisis de Riesgo y Encuesta aplicada a Panel de expertos.
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Variaciones temporales en la cantidad de peces capturados y de muestreos durante el
periodo mayo 2010 –mayo 2011.
Figura 2. Variación temporal en la captura de róbalo durante el periodo de estudio.
Figura 3. Variación temporal en la captura de pejerrey durante el periodo de estudio.
Figura 4. Variación temporal en la captura de chancharro durante el periodo de estudio.
Figura 5. Variación temporal en la captura de rollizo durante el periodo de estudio.
Figura 6. Variación temporal en la captura de cabrilla durante el periodo de estudio.
Figura 7. Variación temporal en la captura de blanquillo durante el periodo de estudio.
Figura 8. Variación temporal en la captura de merluza común durante el periodo de estudio.
Figura 9. Perfil de fluorescencia de productos de PCR tiempo real, todas las especies. A y B
indican los dos comportamientos de amplificación observados.
Figura 10. Electroforesis productos de PCR convencional 18Sr.
Figura 11. Electroforesis productos de PCR convencional 18Sr.
Figura 12. Electroforesis de los controles positivos OMV.
Figura 13. Electroforesis de los controles positivos EHNV.
Figura 14. Electroforesis de los controles positivos IHNV
Figura 15. Electroforesis de los controles positivos VHS
Figura 16. Electroforesis de los controles positivos V. ordalii
Figura 17. Electroforesis de los controles positivos A. salmonicida
Figura 18. Electroforesis de productos de PCR de P. salmonis
Figura 19. Cuantificación relativa de resultados positivos P.salmonis.
Figura 20. Identificación de muestras cuantificadas por especie y zona de origen.
Figura 21. Matriz de identidad al comprar las secuencias 16Sr disponibles en NCBI con la cepa
IRE-99D.
Figura 22. Árbol de escenarios que muestran el flujo de procesos de la transmisión y
establecimiento de un agente patógeno desde peces silvestres/asilvestrado hacia
poblaciones de cultivo.
Figura 23. Árbol de escenarios que muestran el flujo de procesos de la transmisión y
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establecimiento desde peces silvestres/asilvestrado hacia poblaciones silvestres.
Figura 24. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de
P. salmonis en el estuario de Reloncaví.
Figura 25. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de
P. salmonis en Hornopirén.
Figura 26. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de
P. salmonis en Castro.
Figura 27. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de
P. salmonis en Melinka.
Figura 28. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de la transmisión de
P. salmonis en Aysén
Figura 29. Prevalencia anual de P. salmonis en muestras de peces silvestres capturados en torno
a centros de cultivo ubicados en (A) la región de Los Lagos y (B) Región de Aysén.
Figura 30. Zonificación en base al análisis de riesgo de las zonas de estudio.
Figura 31. Distribución de pooles por especie derivados de la Pesca de Investigación en torno a
los centro de cultivo
Figura 32. Cuantificación relativa de resultados positivos a P.salmonis Lote Nº 1 de muestras ACS
Nº 17 por pool de órganos.
Figura 33. Cuantificación relativa de resultados positivos a P.salmonis Lote Nº 1 de muestras ACS
Nº 17 abierto por tejido.
Figura 34. Fuentes de información disponibles organizadas por score de calidad (Rodgers, 2009).
Figura 35. Potenciales vías de introducción y establecimiento de enfermedades en peces en
ecosistema acuícola (Rodgers, 2007).
Figura 36. Esquema de red de cerco con cierre vertical.
Figura 37. (a) Red de cerco de cierre vertical. (b) Flotadores de la red de cerco. (c) Relinga de
plomos y pesos de la red de cerco. (d) Anillas y patas de gallo de la red.
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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Genes reporteros para las especies en estudio.
Tabla 2. Características y métodos de análisis recomendados para agentes patógenos de peces,
según Manual de Diagnóstico de Enfermedades Acuáticas de la OIE y otras referencias
internacionales.
Tabla 3. Propuesta de escala semicuantitativa de Probabilidades.
Tabla 4. Escala semicuantitativa de impactos.
Tabla 5. Matriz de probabilidad final.
Tabla 6. Muestreos realizados por ACS según fecha.
Tabla 7. Nombre común y científico de especies capturadas en la Pesca de Investigación.
Tabla 8. Cantidad de pooles e individuos capturados, según zona muestreada en las pescas de
investigación.
Tabla 9. Cantidad de individuos capturados y conformación de pooles según especie.
Tabla 10. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona del Estuario de
Reloncaví.
Tabla 11. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Castro.
Tabla 12. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Hornopirén.
Tabla 13. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Melinka.
Tabla 14. Cantidad de pooles e individuos capturados, según especie en la zona de Aysén.
Tabla 15. Cantidad de peces capturados y pescas realizadas durante el periodo de estudio.
Tabla 16. Variación temporal en la captura de especies silvestres durante el periodo de estudio
Tabla 17. Valores promedio de longitud y peso de las especies capturadas en las pescas de
investigación.
Tabla 18. Valores promedio de longitud y peso de las especies capturadas en las pescas de
investigación
Tabla 19. Valores promedio de longitud y peso de las especies capturadas en las pescas de
investigación, según tipo de muestreo (lejanía o proximidad)
Tabla 20. Partidores seleccionados identificación de secuencias, gen pesquisado y tamaño del
producto amplificado.

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