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FORSCHUNGSBERICHT DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN
Nr. 3085 / Fachgruppe Physik/Chemie/Biologie
Herausgegeben vom Minister für Wissenschaft und Forschung
Dipl. -Chem. Wigbert Berg
Prof. Dr. Dr. Herbert Witzel
Institut für Biochemie
der Universität Münster
Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus
s
der Endonuclease aus Aspergillus oryzae
1
Springer Fachmedien Wiesbaden GmbH 1981
CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek
Berg, Wigbert:
Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus der
Endonuclease s1 [s) aus Aspergillus oryzae
Wigbert Berg ; Herbert Witzel. - Opladen :
Westdeutscher Verlag, 1981,
(Forschungsberichte des Landes Nordrhein
Westfalen ; Nr. J085 : Fachgruppe Physik,
Chemie, Biologie)
ISBN 978-3-663-19927-4
NE: Witzel, Herbert:; Nordrhein-Westfalen:
Forschungsberichte des Landes •••
© 1981 by Springer Fachmedien Wiesbaden
Ursprünglich erschienen bei Westdeutscher Verlag GmbH, Opladen 1981
Herstellung: Westdeutscher Verlag GmbH
ISBN 978-3-663-19927-4 ISBN 978-3-663-20271-4 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-663-20271-4
- III -
Inhalt
l. Einleitung 1
2. Isolierung 3
3. Charakterisierung der Nuclease S1 5
3 .l. Untersuchung zur Reinheit des isolierten 5
Enzyms
3. 2. Molekülmassenbestimmung 5
3. 3. Stabilität der Nuclease S1
3.4. Isoelektrischer Punkt 5
4. Untersuchungen am Metall-Enzym-Komplex
4.1. Zinknachweis 6
4.2. Versuche zur Desaktivierung der Nuclease S1
durch Komplexbildner und ReaktiviPrung mit Zn2+
4.3. Stabilität der Apo-Nueiease S1 6
4.4. Austauschversuche von Zn2+ gegen andere 7
Metallkationen
4. 5. Modifizierungsreaktionen 8
4.5.1. Modifizierung von Histidin 8
4.5.2. Modifizierung von Carboxylat-Gruppen 9
4.5.3. Modifizierung von Amino-Gruppen 10
4.5.4. Modifizierung von Tyrosin 10
4.5.5. Modifizierung von SH-Gruppen 10
4.5.6. Modifizierung von Guanidinium-Gruppen l l
5. Substratspezifität 11
6. Diskussion und VorstPllung zum Mechanismus 14
der Katalyse
Abbildungsanhang 19
Literaturverzeichnis 23
- IV -
Abkürzungsverzeichnis
A Adenosin
Ade Adenin
Akt. Aktivität
AS Ammoniumsulfat
bispNPP Bis-p-Nitrophenylphosphat
c Cytidin
CMC 1-Cyclohexyl-3-(morpholinyl-ethyl)carbodiimid
d Tage
d Desoxy
DEAM Diethylaminomethylen
DNA Desoxyribonucleinsäure
EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäre
Extinktion bei 280 nm
g Erdbeschleunigung
G Guanos in
Gua Guanin
h Stunden
K Michaelis-Konstante
m
M relative Molekülmasse
r
min Minuten
NPT 51-Thymidylsäure-p-nitrophenylester
aNP 1-Naphthylphosphat
pl Isoelektrischer Punkt
p Phosphat
RNA Ribonucleinsäure
SOS Natrium-dodecylsulfat
T Thymidin
TPN 3'-Thymidylsäure-p-nitrophenylester
Tris Tris-(Hydroxymethyl)aminomethan
u Uridin
u Enzymeinheit: 6E •100/min (Einzelstrang-DNA)
260
wsc wasserlösliches Carbodiimid
> cyclisch
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1. Einleitung
Der erste Bericht über die Notwendigkeit von Zinkionen beim
Wachstum von Aspergillus niger stammt von Raulin (1) aus dem
Jahre 1869. Innerhalb eines Jahrzehnts wurde dann das Vorkommen
von Zink in tierischen und pflanzlichen Geweben nachgewiesen
(2,3), Erst 1934 wurde an Nagetieren bewiesen, daß Zinkionen
allgemein für das Wachstum notwendig sind (4).
1940 entdeckten Keilin und Mann (5), daß Zink in einem Enzym,
der Carboanhydrase, gebunden vorkommt und für die Aktivität
notwendig ist. Erst 15 Jahre später berichteten Yallee und
Neurath (6) über ein zweites Enzym, die Carboxypeptidase A aus
Rinderpankreas, die Zinkionen für die Katalyse benötigt und
nachweislich ein g-Atom Zink pro Mol Enzym enthält.
Die weite Verbreitung von Zink-Metalleenzymen erkannte man erst
in den letzten 10 Jahren. So sind bis heute 157 Zink-Metalle
enzyme bekannt; sie sind in allen Enzymklassen vertreten, unter
anderem bei den Dehydrogenasen, Transferasen, Phosphatasen und
Peptidasen, Aldolasen, Isomerasen und Polymerasen.
Das Aktivitätsoptimum der Zink-Metalleenzyme liegt normalerwei
se im neutralen bis alkalischen pH-Bereich. Ausnahmen bilden
zwei Phosphorsäurediesterasen, die Nuclease P aus Penicillium
1
citrium (7) und die hier untersuchte Endonuclease 5 aus Asper
1
gillus oryzae (beide unter E.C. 3.1.30.1), die beide ihr pH-Op
timum bei pH 5 haben.
Die Endonuclease 5 wurde erstmals von Ando (8) aus Takadiasta
1
se, einem lyophilisierten Amylasekonzentrat aus Aspergillus
oryzae, isoliert und charakterisiert. Sie spaltet DNA und RNA
in die 5'-Nucleotide, wobei Einzelstrang-DNA 75 OOOmal schnel
ler gespalten wird als native Doppelstrang-DNA, Weitere Unter
suchungen an polymeren Substraten wurden später von Sutton (9),
Rushizki et al. (10), Wiegand et al. (11) und Zechel et al.
(12) durchgeführt. Die von Ando (8) schon beobachtete Aktivie
rung der Nuclease 51 durch Zn2+ und die Inhibierung durch EDTA
wurde von Vogt (13) bestätigt und ließ vermuten, daß das native
Enzym Zn2+ als Cofaktor benötigt. Die Richtigkeit dieser Annah
m~ konnte von Berg (14,15) inzwischen bewiesen werden.
Dle Aufgabe der Metallionen im katalytischen Prozeß ist trotz
umfangreicher Untersuchungen noch immer nicht völlig geklärt.
Besonders intensiv untersucht wurden die Carboanhydrase C, die
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Carboxypeptidase A, die Alkohol-Dehydrogenase, die Alkalische
Phosphatase aus E. coli und das Thermolysin (16,17).
Dabei werden unterschiedliche Funktionen des Zinkions disku
tiert:
1. Lewis-Säure Katalyse, verknüpft mit einer Substratbindung
und einer Bindungspolarisierung in Richtung der Koordina
tionssphäre des Zinkions,
2. Erhöhung der Nucleophilie von Aquoliganden, die durch die
Liqandierung zum Zn2+ bei pH 7-8 bereits in Hydroxoliganden
übergehen können,
3. Erleichterung eines nucleophilen Angriffs auf das Substrat
durch Ladungsneutralisation im Grund- oder Übergangszustand,
4. Erleichterung der Reaktion durch definierte Bindung der
Reaktanden im aktiven Zentrum des Enzyms.
Wieweit diese Funktionen bei einer enzymkatalysierten Hydrolyse
von Phosphorsäureesterbindungen in Betracht kommen, kann nicht
ohne weiteres vorausgesagt werden. Bemerkenswert ist, daß Zink
und Bleiionen auch in einer Acetat-gepufferten Lösunq mit einem
Optimum bei pH 8-9 die Ribonucleinsäure zu den 2'- und 3'-Nuc
leotiden bzw. Nucleosiden spaltet.
Bei den hier in Angriff genommenen Untersuchungen stehen zu
nächst Probleme zur besseren Isolierung, zur Enzymstabilität,
zur Ligandsphäre des Zn2+ und zur Austauschbarkelt des Metall
ions im Vordergrund.
Im weiteren Verlauf muß die Substratspezifität abgegrenzt wer
den. Solche Untersuchungen wurden bereits von Niermann (18) be
gonnen. Er konnte aus den Geschwindigkeiten für die Spaltung
von Dinucleosidphosphaten und synthetischen 3'-Nucleotid-di
estern ableiten, daß die Base des 3'-Nucleotids zur Vororien
tierung des Substrates benötigt wird. Gleichzeitig scheint das
3'-Nucleosid die Austrittsgruppe zu sein, während bei vielen
alkalischen Phosphorsäurediesterasen, die ebenfalls die 5'-Nuc
leotide liefern, das 5'-Nucleotid gebunden wird und das 3'-Nuc
leosid als Austrittsgruppe betrachtet werden muß (19,20).
Da die Nuclease 5 neben Phosphorsäurediestern auch Phosphor
1
säuremonoester spaltet, ergibt sich eine weitere Möglichkeit
zum Studium des Reaktionsverlaufs. Vor allem interessiert hier
der Einfluß einer Vororientierung des Substrates auf die Hydro
lysegeschwindigkeit, die durch gezielte Modifikationen an Base
und Zucker untersucht werden kann.
- 3 -
Andererseits muß jetzt auch diskutiert werden, ob das hier vor
liegende Enzym in vivo überhaupt als Diesterase fungiert oder
ob die 3'-Nucleotidaseaktivität im Vordergrund steht. In diesem
Falle könnte das Enzym die beim RNA-Abbau durch die in den
Aspergillus-Extrakten in hoher Konzentration vorliegenden Ribo
nucleasen T1 und T2 erzeugten 3'-Nucleotide durch Dephosphory
lierung wieder dem Nucleosidpool zuführen.
2. Isolierung
Die Isolierung wurde in Anlehnung an die Verfahren von Vogt (13)
und Niermann (18) durchgeführt. Das Verfahren mußte teilweise
abgeändert werden, um eine 10-20fache Menge an Enzym erhalten
zu können. Als Ausgangsmaterial diente ein Enzymgemisch aus
Aspergillus oryzae der luitpold Werke München*>.
Das folgende Schema 1 faßt alle Trennoperationen des Isolie
rungsganges, die jeweils bei 4 °C durchgeführt wurden, zusammen.
Schema 1:
500 g Enzymgemisch aus Aspergillus oryzae
I in 3000 ml H 0 auflösen, auf pH 4,6
2
i titrieren, 2 h rühren
Rohextrakt
portionsweise Zugabe von 330 g/1
___j Ammoniumsulfat (50 %ige Sättigung),
Sediment 1 4 h rühren, 1 h zentrifugieren bei
verworfen ----- 12 QQQ X g
Oberstand
portionsweise Zugabe von 190 g/1
Ammoniumsulfat (80 %ige Sättigung),
Oberstand 12 h rühren, 1 h zentrifugieren bei
verworfen 12 QQQ X g
Sediment
j in 300 ml H20 aufgenommen, Sephadex
G 75 Gelchromatographie,
Elutionsmittel: 0,05 M Acetatpuffer,
pH 4,6; Säule: 6 x 60 cm
aktive Fraktionen
DE 32 Anionenaustauschchromatographie
Elutionsmittel: 0,02 M Tris/HCl
j
Puffer, pH 7,5 und 0,05 M NaCl,
linearer Gradient: 0,05 M/0,4 M NaCl;
Säule: 6 x 30 cm
aktive Fraktionen
*) Herrn Dr. Wolff, luitpold Werke, sei hier für die Bereit
stellung des Ausgangsmaterials gedankt.
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aktive Fraktionen
Ultrafiltration, Amicon Membranfilter
j DM OS, Sephadex SP-C-SO Kationenaus
tauschchromatographie,
Elutionsmittel: O,OS M Acetatpuffer,
pH 4,4; Säule: 3 x 60 cm
aktive Fraktionen
j Ultrafiltration, Amicon Membranfilter
DM OS, Sephadex G 7S Gelchromatogra
phie, Elutionsmittel: O,OS M Acetat
puffer, pH S; Säule: 3 x 100 cm
aktive Fraktionen
Sephadex SP-C-SO Kationenaustausch
j chromatographie,
Elutionsmittel: O,OS M Acetatpuffer,
pH 3,S, linearer Gradient: pH 3,S/4,8;
Säule: 3 x 30 cm
Endpräparation
Nach dieser Operation konnte das Enzym etwa 3000fach angerei
chert werden bei einer Ausbeute von 10 %.
Die Bilanz des gesamten Isolierungsganges zeigt Schema 2.
Schema 2:
Reinigungs- Volumen Akti- Gesamt- spez. Aus- Reini-
[280
schritt vität akt. Akt. beute gung
(ml) (U/ml) (lo-5u) (U/mg) (%)
Rohextrakt 3000 400 12,0 200 2 "100" "1"
AS-Fällung 300 2800 8,4 180 16 70 8
G 7S I 800 900 7,2 32 28 60 14
DE 32 300 1100 3,3 4,1 270 28 l3S
SP-C-SO I 120 1800 2,2 1,9 9SO 18 47S
G 7S II 100 1900 1,8 0,9 2000 lS 1000
SP-C-SO II 120 9SO 1' 1 O,lS 6300 10 31SO
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3. Charakterisierung der Nuclease S1
3.1. Untersuchungen zur Reinheit des isolierten Enzyms
Die erste Beurteilung für die Einheitlichkeit der Proteinfrak
tion ergibt sich daraus, daß keine Steigerung der spezifischen
Aktivität erreicht werden kann. Weiterhin sollten bei den chro
matographischen Verfahren Protein- und Aktivitätspeak überein
stimmen. Für die Endpräparation des oben beschriebenen Verfahren
trifft dieses zu (Abb. 1).
Die Diskelektrophorese bei pH 8,9 in einem 11 %igen Polyacryl
amidgel nach Maurer (21) zeigt jedoch nach Anfärbung mit Coo
massie brilliant blue neben einer intensiven Hauptbande noch
eine schwache zweite Bande, die auf ca. 5 % Verunreinigung zu
rückschließen läßt.
3.2. Molekülmassenbestimmung
Eine nach Weber und Osborn (22) durchgeführte Molekülmassenbe
stimmung mit Hilfe der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in
Gegenwart von Vergleichsproteinen ergab nach Auftragung der
Wanderungsgeschwindigkeit gegen log Mr eine Molekülmasse von
=
Mr 36 000. Dieser Wert ist mit der aus einer Gelchromato
graphie an Sephadex G 75 bestimmten Molekülmasse identisch.
Bei diesen Untersuchungen ergaben sich keine Hinweise auf Un
tereinheiten.
3.3. Stabilität der Nuclease S1
Nach Vogt (13) besitzt die Nuclease S1 eine relativ hohe Sta
bilität, gemessen an der Inaktivierung bei Temperaturerhöhung.
Nach der G 75 li-Säule beträgt die Halbwertszeit für die Akti
vitätsabnahme bei pH 4,6 etwa ein Jahr. Nach Abtrennung von
Begleitproteinen auf der SP-C-50 II wurde hier in der hochgerei
nigten Fraktion eine Abnahme der Halbwertszeit auf 5 Tage beob
achtet. Deshalb wurden die Enzymlösungen auf der vorletzten Stu
fe aufbewahrt. Einfrieren und Gefriertrocknung ergaben dabei nur
einen geringfügigen Aktivitätsverlust. Erst vor Einsatz für wei
tere Untersuchungen wurde die letzte Reinigung vorgenommen.
3.4. Isoelektrischer Punkt
Der von Rushizky et al. (10) bestimmte isoelektrische Punkt von
pl = 4,3-4,4 konnte anhand von isoelektrischer Fokussierung
bestätigt werden.
