TESE Afonso Cordeiro Agra Neto

97 Pages·2014·4.96 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

TESE DE DOUTORADO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL INSETICIDA DE LECTINAS DE
SEMENTES DE Moringa oleifera CONTRA LARVAS DE Aedes aegypti
RESISTENTES E SUSCEPTÍVEIS A ORGANOFOSFATO E ADULTOS
DESitophilus zeamais

AFONSO CORDEIRO AGRA NETO

ORIENTADORA: PROFª. DRª. PATRÍCIA MARIA GUEDES PAIVA
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO

RECIFE
2014
AFONSO CORDEIRO AGRA NETO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL INSETICIDA DE LECTINAS DE SEMENTES DE Moringa
oleifera CONTRA LARVAS DE Aedes aegypti RESISTENTES E SUSCEPTÍVEIS A
ORGANOFOSFATO E ADULTOS DE Sitophilus zeamais

Tese apresentada para o cumprimento parcial das
exigências para obtenção do título de Doutor em
Ciências Biológicas pela Universidade Federal de
Pernambuco.

ORIENTADORA: PROFª. DRª. PATRÍCIA MARIA GUEDES PAIVA
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO

RECIFE
2014

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL INSETICIDA DE LECTINAS DE SEMENTES DE Moringa
oleifera CONTRA LARVAS DE Aedes aegypti RESISTENTES E SUSCEPTÍVEIS A
ORGANOFOSFATO E ADULTOS DE Sitophilus zeamais

AFONSO CORDEIRO AGRA NETO

Banca Examinadora

PROFª. DRª. PATRÍCIA MARIA GUEDES PAIVA
ORIENTADORA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

PROFª. DRª. LUANA CASSANDRA BREITENBACH BARROSO COELHO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

DR. EMMANUEL VIANA PONTUAL
UNIVERSIDADE FEDERALDE PERNAMBUCO

PROFª. DRª. DANIELA DO AMARAL FERRAZ NAVARRO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

PROF. DR. FRANCIS SOARES GOMES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

RECIFE
2014
Dedico este trabalho a Deus, que
sempre me fortaleceu em momentos de
dificuldades e a minha querida esposa
pelo constante apoio e carinho.
AGRADECIMENTOS

ÁDeus, por sempre me manter fortalecido e resiliente nos momentos de dificuldades. Por estar sempre
a minha frente me guiando, ao meu lado me acompanhando e atrás me protegendo.
Aos meus queridos pais, Roberto e Leonize, dos quais herdei um comportamento ético e retilíneo, e
que sempre me apoiaram em todas as decisões que tomei na minha vida acadêmica e profissional.
Às minhas irmãs queridas, Manuella, Camilla e Melina, que sempre me apoiaram e comemoraram as
minhas conquistas. Tenho orgulho das profissionais, mulheres e mães que se tornaram.
Aos meus sobrinhos e sobrinhas, pelo simples fato de existirem. Em momentos difíceis, a inocência
deles me trouxe tranqüilidade e esperança.
Aos meus sogros, cunhados e com-cunhadas. Em especial a minha sogra pelas demonstrações de
preocupação com minha vida acadêmica e profissional. Agradeço por tê-los como minha família.
Aos meus cunhados (maridos de minhas irmãs), que mesmo sem saberem, me ajudaram pelo simples
fato de proporcionarem momentos de descontração.
Aos meus primos André e Alana Pedrosa pelos vários momentos de alegria e descontração que
vivenciamos.
À minha orientadora Drª Patrícia Paiva, pelo acolhimento e pela confiança a mim depositada. Sem
dúvida, uma das pessoas responsáveis pelo meu crescimento acadêmico e sei que posso contar com ela
sempre. Tornou-se mais que uma orientadora, uma amiga.
Ao meu amigo e co-orientadorDr. Thiago Henrique, pelas orientações desde a época do mestrado. Foi
uma pessoa que, mesmo sem saber, durante meus anseios e inquietações me passou serenidade.
À Drª Daniela Navarro, por ceder cordialmente o Laboratório para a realização dos testes com Aedes
aegypti.
Aos meus amigos de laboratório: Emmanuel, Luciana, Igor, Lidiane, Nataly, Maiara, Kézia, Ana
Patrícia, Thâmara, Lívia, Rayana, Francis e Idila, por proporcionarem momentos de alegria dentro e
fora do Laboratório.
RESUMO

Algumas espécies de insetos podem atuar como vetores de doenças ou pragas agrícolas. O
mosquito Aedes aegypti é o vetor da dengue e o besouro Sitophilus zeamais (gorgulho do
milho) ataca diversos tipos de grãos armazenados. O surgimento de populações de insetos
resistentes em decorrência da utilização de inseticidas sintéticos tem estimulado a busca por
inseticidas naturais, incluindo as lectinas (proteínas que reconhecem especificamente
carboidratos). Sementes de Moringa oleifera contêm as lectinas inseticidas cMoL (do inglês
coagulant M. oleifera lectin) e WSMoL (do inglês water-soluble M. oleifera lectin). Para o
isolamento de WSMoL, o extratoem água destilada de sementes de M. oleifera(EA) foi obtido
e tratado com sulfato de amônio (60% de saturação) obtendo-se uma fração rica em lectina
(FL), a qual foi aplicada em coluna de quitina. Já para o isolamento de cMoL, o extrato em
NaCl 0,15 M foi obtido pela homogeneização das sementes em NaCl 0,15 M tratado com
sulfato de amônio (60% de saturação) e cromatografado em coluna de gel de guar. Em
seguida, o efeito das lectinasna sobrevivência e nas atividades de enzimas detoxificantes e
digestivas de larvas de A. aegypti no quarto estágio das linhagens Rockefeller (susceptível ao
organofosfato temefós) e Rec-R (resistente ao organofosfato temefós)foi avaliado. Investigou-
se também os efeitos de EA, FL e WSMoLna sobrevivência e na atividade da tripsina de S.
zeamais. WSMoL (0,197 mg/ml) matou as larvas Rockefeller (51,6%±2,8), enquanto cMoL
não interferiu na sobrevivência dessas larvas. WSMoL e cMoL não apresentaram atividade
larvicida contra Rec-R. WSMoL estimulou as atividades de proteases, tripsina e α-amilase das
larvas Rockefeller, enquanto cMoL inibiu essas enzimas. WSMoL não interferiu na atividade
de tripsina de larvas Rec-R, mas inibiu as atividades de protease e α-amilase. Dentre as
atividades de enzimas digestivas de Rec-R, cMoLapenas inibiu a atividade de tripsina. cMoL
inibiu fortemente a atividade de superóxido dismutase das larvas Rockefeller e Rec-R e
WSMoL inibiu a atividade de β-esterase de larvas Rockefeller. As lectinas afetaramlevemente
as atividades de α-esterase de ambas as linhagens. EA (58 à 145mg/g ) apresentou toxicidade
aguda para S. zeamais (taxas de mortalidade variando de 21,7 a 50%), enquanto FL não matou
os insetos. WSMoL causou apenas baixa mortalidade (12,0%±2,7) na concentração de 60
mg/g (mg de lectina por g de farinha de trigo). A ingestão de EA reduziu a taxa de consumo
relativo, sendo observado efeito deterrente moderado a forte. FL e WSMoL reduziram a taxa
de ganho relativo de biomassa e a eficiência na conversão do alimento ingerido, mas não
exerceram ação deterrente. Apenas WSMoLaumentou a atividade de enzimas tripsina do
intestino de S. zeamais. A presente tese apresenta ainda um capítulo contendo uma revisão
bibliográfica que contempla características da biologia e ecologia de insetos praga de grãos
armazenados, bem como informações sobre danos causados por eles na agricultura. As
principais estratégias de controle e o uso de inseticidas naturais como alternativa de combate a
estas pragas são também discutidos. Em conclusão: (1) WSMoL, embora seja capaz de matar
larvas de A. aegypti susceptíveis a organofosfato (Rockefeller), não promoveu mortalidade de
larvas resistentes (Rec-R); (2) os efeitos opostos de WSMoL na sobrevivência de larvas
Rockefeller e Rec-R podem indicar que estas populações são fisiologicamente distintas em
outros aspectos além da resistência a temefós; (3) os efeitos distintos de WSMoL e cMoL
sobre as enzimas digestivas de larvas Rockefeller e Rec-R indicam a expressão de diferentes
formas de enzimas entre essas linhagens; (4) o mecanismo de atividade larvicida de WSMoL
para larvas Rockefeller pode envolver a estimulação de enzimas digestivas (proteases, tripsina
e α-amilase) e inibição da atividade de β-esterase; (5) cMoL pode ser avaliada, no futuro,
como um agente sinérgico para aumentar a susceptibilidade de larvas de A. aegypti com
atividade aumentada de superóxido dismutase; (6) a toxicidade de EA para S. zeamais adultos
pode resultar do seu efeito deterrente de alimentação; e (7) os danos na fisiologia nutricional
de S. zeamais causados por WSMoL provavelmente envolvem um desequilíbrio do processo
de digestão devido ao aumento da atividade de enzimas tripsina.

Palavras-chave: mosquito da dengue; gorgulho do milho; atividade larvicida; atividade
deterrente; lectina.
ABSTRACT

Some insect species can act as disease vectors or agricultural pests. The Aedes aegypti
mosquito is vector of dengue fever and the beetle Sitophilus zeamais (maize weevil) attacks
several types of stored grains. The emergence of resistant insect populations due to the use of
synthetic insecticides has stimulated the search for natural insecticides, including the lectins
(proteins that specifically recognize carbohydrates). Moringa oleifera seeds contain the
insecticidal lectins cMoL (coagulant M. oleiferalectin) and WSMoL (water-soluble M.
oleifera lectin). In this work, the aqueous extract from Moringa oleifera seeds (AE) was
obtained and treated with ammonium sulfate (60% saturation) for obtaining a lectin-rich
fraction (LF), which was loaded onto a chitin column for isolation of WSMoL. The saline
extract was obtained by homogenization of the seeds in 0.15 M NaCl and cMoL was isolated
from it by treatment with ammonium sulphate (60%) and chromatography on guar gel
column. Next, the effect of the lectins on survival and activities of detoxificant and digestive
enzymes ofA. aegypti fourthstage larvae (L ) from Rockefeller and Rec-R (resistant to the
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organophosphate temephos) strains were evaluated. Were also evaluatedthe effects of AE, LF
andWSMoL on survival and trypsin activity of S. zeamais. WSMoL (0.197 mg/ml) killed the
Rockefeller larvae (51.6%±2.8) while cMoL did not affect the survival rate of them. WSMoL
and cMoL did not show larvicidal activity against Rec-R. WSMoL stimulated the activities of
proteases, trypsin and α-amylase from Rockefeller larvae, while cMoL inhibited these
enzymes. WSMoL did not interfere with the activity of trypsin from Rec-R larvae but
inhibited the activities of protease and α-amylase. Among the activities digestive enzymes
from Rec-R, cMoL only inhibited the trypsin activity. cMoL strongly inhibited superoxide
dismutase from Rockefeller and Rec-R larvae and WSMoL inhibited the activity of β-esterase
from Rockefeller. The lectins slightly affected the activity of α-esterase of both larval strains.
AE (58 à 145mg/g) was acutely toxic to S. zeamais (mortality rates ranging from 21.7 to 50%)
while LF did not kill the insects. WSMoL caused only a slight mortality (12.0 ± 2.7) at 60
mg/g (mg of lectin per g of wheat flour). The intake of AE reduced the relative consumption
rate, being observed a moderate to strong deterrent effect. LF and WSMoL decreased the
relative biomass gain rates and the efficiency in conversion of ingested food, but did not
exerted deterrent action. Only WSMoL interfered in trypsin-like activity from S. zeamais gut.
This thesis also presents a chapter containing a literature review that includes characteristics
of biology and ecology of stored-grain pests, as well as informations on damages caused by
them in agriculture. The main strategies for control and the use of natural insecticides as an
alternative to combat these pests are also discussed. In conclusion, (1) WSMoL, although is
able to kill organophosphate-susceptible (Rockefeller) A. aegypti larvae, did not promote
mortality of resistant (Rec-R) larvae; (2) the opposite effects of WSMoL on the survival of
Rockefeller and Rec-R larvae may indicate that these populations are physiologically distinct
in other aspects beyond the resistance to temephos; (3) the different effects of WSMoL and
cMoL on digestive enzymes from Rockefeller and Rec-R larvae indicate expression of
different enzyme forms between these strains; (4) the mechanism of larvicidal activity of
WSMoL on Rockefeller larvae may involve stimulation of larval digestive enzymes (protease,
trypsin, and α-amylase) and inhibition of β-esterase activity; (5) cMoL can be evaluated in
the future as a synergist for increasing the susceptibility of A. aegypti larvae with increased
SOD activity; (6) the toxicity of AE to S. zeamais adults can result from its feeding-deterrent
activity; and (7) the damage to nutritional physiology of S. zeamais by WSMoL probably
involves an imbalance of digestion process due to the increase in activity of trypsin-like
enzymes.
Key words: dengue mosquito; maize weevil; larvicidal activity; deterrent activity; lectin.
Lista de Figuras

Pág
Fundamentação teórica

Figura 1. Ciclo biológico do A. aegypti. 14

Figura 2. Morfologia externa de Sitophilus zeamais. 16

Figura 3. Ensaio de hemaglutinação. 23

Figura 4. Aspectos de Moringa oleifera: (A) árvore, (B) sementes. 27

Capítulo 1
Figure 1. Effect of WSMoL and cMoL on protease (a, b), trysin-like (c, d), and α-amylase 52
(e, f) activities from A. aegypti Rockefeller L4.

Figure 2. Effect of WSMoL and cMoL on protease (a, b), trysin-like (c, d), and α-amylase 53
(e, f) activities from A. aegypti Rec-R L4.

Figure 3. Effects of WSMoL and cMoL on SOD (a, b), α-esterase (c, d), and β-esterase 54
(e, f) activities from A. aegypti Rockefeller (a, c, e) and Rec-R (b, d, f) L4.

Capítulo 2

Figure 1. Representative drawings of stored-grain pests belonging to the respective
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families and species: (A)Bruchidae, Callosobruchus maculatus; (B) Curculionidae,

Sitophilus zeamais; (C) Laemophoeidae, Cryptolestes ferrugineus; (D) Silvanidae,

Oryzaephilus surinamensis; (E) Tenebrionidae, Tribolium castaneum; (F) Liposcelidae,

Liposceles sp.

Figure 2. Establishment of an insect resistant population due to the excessive, intermittent
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and unplanned use of an insecticide.

Capítulo 3
Figure 1. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets containing 90
(A) aqueous extract from M. oleifera seeds (58 to 145 mg of protein per g of wheat flour)
or (B) lectin-rich fraction obtained after treatment of extract with ammonium sulphate
(14.5 to 58 mg of protein per g of wheat flour). The relative biomass gain rate indicates the
amount of biomass in mg gained every day per mg of initial body weight. The efficiency
in conversion of ingested food (%) indicates the amount of ingested food incorporated by
insects as biomass. The relative consumption rate indicates the amount of food consumed
in mg per mg of insect body weight per day. Each bar corresponds to the mean ± SD of
four replicates. Different letters indicate significant (p < 0.05) differences between
treatments.

Figure 2. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets containing 91