Desenvolvimento de Metodologias Analíticas para a Determinação de Resíduos de Pesticidas em

154 Pages·2007·3.56 MB·Portuguese

Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa
Mestrado em Controlo da Qualidade
e Toxicologia dos Alimentos

Desenvolvimento de Metodologias
Analíticas para a Determinação de
Resíduos de Pesticidas em
Medicamentos à Base de Plantas

Rita Vasconcelos Pimentel
2007

Desenvolvimento de Metodologias
Analíticas para a Determinação de
Resíduos de Pesticidas em
Medicamentos à Base de Plantas

Dissertação destinada à obtenção do grau de Mestre em
Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, pela
Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa

Dissertação Orientada por:
Professora Doutora M. Rosário Bronze
e
Professor Doutor Higuinaldo Chaves das Neves

Rita Vasconcelos Pimentel
2007

Resumo

Resumo

A preocupação com os produtos à base de plantas medicinais tem sido amplamente
discutida, uma vez que se verifica um aumento da sua utilização nos últimos anos.

A Directiva 2004/24/CE do Parlamento Europeu e do Conselho de 31 de Março de 2004
e sua transposição para o Decreto-Lei 176/2006 veio reforçar a necessidade dos
medicamentos tradicionais à base de plantas serem submetidos a um processo de registo
para a sua introdução no mercado, no qual a qualidade tem que ser demonstrada,
devendo ser cumpridas as normas da qualidade constantes das monografias relevantes
da Farmacopeia Europeia ou da farmacopeia do Estado-Membro.

Documentos emitidos pela Agência Europeia da Avaliação de Medicamentos referem
que os resíduos de pesticidas devem ser considerados entre os vários contaminantes a
que as plantas medicinais possam estar sujeitas.

Neste âmbito, o objectivo deste trabalho foi o de optimizar, validar e aplicar a
metodologia analítica descrita na Farmacopeia Europeia para a pesquisa de resíduos de
pesticidas organoclorados e piretróides em medicamentos à base de plantas.

A extracção sobre a amostra foi efectuada com acetona, seguida de cromatografia de
permeação em gel e extracção em fase sólida. Foi utilizada a cromatografia gasosa com
detector de captura electrónica para a determinação dos compostos e a espectrometria de
massa para a confirmação da identificação.
Uma vez que se trata de um método multiresíduo no qual numa só análise são
determinados 27 compostos, a fase de optimização do processo de extracção e
purificação das amostras foi particularmente crítica, pois houve a necessidade de ter
cuidados especiais por forma a aumentar os factores de recuperação e a repetibilidade
do método analítico. Foram também optimizadas as condições de separação dos
compostos por cromatografia gasosa.

Nos últimos anos, várias publicações evidenciaram a utilização de métodos alternativos
de preparação de amostra, apresentando uma maior rapidez, simplicidade de execução
com menores custos comparativamente aos processos de extracção clássicos. Este facto
reforçou o interesse em estudar metodologias alternativas de extracção e comparar
resultados obtidos.

O método descrito na Farmacopeia Europeia demonstrou ser o mais adequado para a
pesquisa de resíduos de pesticidas organoclorados e piretróides nas amostras
analisadas, após optimização do processo de extracção.

Palavras chave: Resíduos de Pesticidas; Medicamentos à base de plantas;
Método multiresíduo; Cromatografia Gasosa.
i
Abstract

Abstract

In recent years we have witnessed an increasing use of herbal medicines which lead to
several concerns and fears.

The Directive 2004/24/EC of the European Parliament and of the Council of 31 March
2004 and its transposition to the Decree-Law 176/2006 came to strengthen the need of
traditional herbal medicinal products to be submitted to a registration procedure, in which
the quality has to be demonstrated, and therefore these products should comply with
quality standards in relevant European Pharmacopoeia monographs or those in the
pharmacopoeia of a Member State.

Documents emitted by the European Agency for the Evaluation of Medicinal Products
indicated that pesticide residues must be considered among the contaminants of medicinal
plants.

The aim of this work was to optimize, validate and apply the described European
Pharmacopoeia analytical methodology for the research of organochlorine and pyrethroid
pesticide residues in herbal medicinal products.

The sample extraction was made with acetone followed by gel permeation
chromatography and solid phase extraction. Gas chromatography with electron capture
detector was used for the determination of the compounds and mass spectrometry for the
confirmation of the identification.
As it is a multiresidue method in which only one analysis allows the determination of 27
compounds, it was necessary to have special attention in the optimization of the samples
extraction and cleanup, therefore it was necessary to have special cares in order to
increase the accuracy and the repeatability of the analytical method. The conditions for
the separation of the compounds by gas chromatography were also optimized.

Lately, several publications described that the use of alternative methods for sample
preparation showed to be faster, easy to perform and cheaper in comparison to
conventional methods. This fact strengthened the interest of studying alternative
methodologies of extraction and comparing results.

The methodology described in the European Pharmacopoeia demonstrated to be suitable
for the research of organochlorine and pyrethroid pesticide residues in the analyzed
samples, after a careful optimization of all the extraction process.

Keywords: Pesticide residues; Herbal medicinal products; Multiresidue method;
Gas Chromatography.
ii
Agradecimentos

Agradecimentos

À Prof. Doutora Maria do Rosário Bronze, orientadora deste trabalho, quero agradecer
todo o apoio prestado ao longo de todo o trabalho experimental e durante a elaboração da
tese, a sua inesgotável paciência, disponibilidade, objectividade na transmissão de
conhecimentos, todas as críticas construtivas e sugestões que permitiram enriquecer o
trabalho.

Ao Prof. Doutor Higuinaldo Chaves das Neves, orientador deste trabalho, quero
agradecer a sua contribuição imprescindível na transmissão de todos os seus
conhecimentos, o que foi determinante para a execução do trabalho experimental e para a
elaboração da tese, assim como todas as suas críticas construtivas. Agradeço também a
sua disponibilidade sempre manifestada.

Agradeço ao INFARMED que me disponibilizou desde o início todas as condições
materiais que tornaram possível a execução do trabalho experimental apresentado nesta
tese, assim como a todas as colegas que de uma forma ou de outra me auxiliaram durante
elaboração do trabalho.

Agradeço a todos aos colegas de mestrado e à Prof. Doutora Matilde Castro todo o apoio
manifestado ao longo do mestrado.

A toda a minha família, em especial ao Nuno e ao Tiago quero agradecer toda a
compreensão e apoio manifestados desde o início.

iii
Índice

Índice

Resumo i
Abstract ii
Agradecimentos iii
Índice iv
Índice de figuras viii
Índice de tabelas xi
Símbolos e Abreviaturas xiv

I. Introdução 1
1. Medicamentos à base de plantas e aspectos regulamentares 1
2. Contaminantes - Resíduos de Pesticidas 5
2.1. Definição e sua utilização ao longo dos tempos 5
2.2. Classes de pesticidas 6
2.2.1. Pesticidas Organoclorados 6
2.2.2. Pesticidas Organofosforados 7
2.2.3. Pesticidas Carbamatos 7
2.2.4. Pesticidas Piretróides 8
2.3. Resíduos de pesticidas em medicamentos à base de plantas 8
3. Metodologia analítica 13
3.1. Aspectos gerais 13
3.2. Extracção e Purificação 14
3.2.1. Cromatografia de exclusão molecular 15
3.2.2. Extracção em fase sólida - Purificação com sílica gel 16
3.2.3. Métodos alternativos 17
3.3. Separação e detecção - Cromatografia em fase gasosa associada a detector μECD 19
3.3.1. Fonte de gás de arraste 20
3.3.2. Sistema de injecção da amostra 20
3.3.3. Coluna e forno 20
3.3.4. Detector 21

iv
Índice

3.4. Confirmação - Cromatografia em fase gasosa associada a Espectrometria de Massa 22
3.4.1. Fonte iónica 23
3.4.2. Analisador de massas 23
3.4.3. Detector de iões e tratamento de dados 23
4. Amostras a considerar na determinação de resíduos de pesticidas 24
5. Objectivos do trabalho 24

II. Parte experimental 25
1. Materiais e métodos 25
1.1. Padrões 25
1.2. Amostras 26
1.3. Reagentes 26
1.4. Extracção e purificação da amostra 27
1.4.1. Metodologia descrita na Farmacopeia Europeia 27
1.4.2. Metodologia segundo QuEChERS 27
1.5. Análise por GC-µECD 28
1.6. Análise por GC-MS 29
2. Soluções de trabalho 30
2.1. Preparação de soluções 30
2.1.1. Solução mãe combinada de padrões 30
2.1.2. Soluções de padrão interno 31
2.1.3. Solução combinada de padrões utilizada durante a optimização do método 31
2.1.4. Soluções combinadas de padrões para o estudo da linearidade e gama de
trabalho 31
2.1.5. Soluções combinadas de padrões para o estudo da precisão 33
2.1.6. Soluções combinadas de padrões para a determinação dos limites analíticos 35
2.1.7. Soluções de amostra fortificada para o estudo da exactidão 35
2.2. Armazenamento de soluções 36
3. Validação do método analítico 37
3.1. Especificidade/Selectividade 37
3.2. Estudo da linearidade 37
3.3. Estudo da gama de trabalho 38
3.4. Estudo da precisão 38
3.4.1. Repetibilidade da injecção 38
3.4.2. Repetibilidade 39
3.4.3. Precisão intermédia 39
v
Índice

3.5. Estudo dos limites analíticos 39
3.6. Estudo da exactidão 39

III. Resultados e Discussão 40
1. Análise por GC-µECD - Optimização das condições cromatográficas 40
1.1. Estudo da eficiência da coluna cromatográfica em função da velocidade linear da fase
móvel 40
1.2. Avaliação do Factor de Resolução 41
1.2.1. Optimização da temperatura do forno da coluna 43
1.2.2. Optimização do fluxo do gás de arraste 45
1.3. Optimização das condições do injector 46
1.3.1. Temperatura do injector 46
1.3.2. Tipo de injecção 51
1.3.3. Tipo de liner 54
1.4. Detector 56
1.5. Escolha do padrão interno 57
1.6. Adequabilidade do sistema 58
2. Análise por GC-MS 62
3. Optimização do processo de extracção e purificação da amostra segundo a metodologia
descrita na Farmacopeia Europeia 69
3.1. Evaporação do solvente no evaporador rotativo 69
3.2. Teste da adequabilidade dos filtros 75
3.3. Cromatografia de exclusão molecular – Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) 76
3.4. Extracção em fase sólida com colunas de sílica gel 79
3.5. Evaporação do solvente em atmosfera de azoto 81
3.6. Avaliação do processo de extracção 81
4. Método alternativo de preparação de amostra - QuEChERS 82
5. Validação do método analítico 84
5.1. Estudo da Especificidade/Selectividade 84
5.1.1. Identificação por GC-MS 84
5.1.2. Avaliação do tempo de retenção e resolução 85
5.1.3. Avaliação de brancos 85
5.1.4. Avaliação da matriz das amostras 86
5.2. Estudo da linearidade 87

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