Table Of ContentAgronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
www.mag.go.cr/rev agr/index.html www.cia.ucr.ac.cr
Nota técnica
CRIOCONSERVACIÓN DE ÁPICES Y SEMILLAS DE CEDRO
(Cedrela odorata L.) MEDIANTE LAS TÉCNICAS DE VITRIFICACIÓN
Y DESHIDRATACIÓN
Tatiana García Rojas*, Ana Abdelnour Esquivel1/*
Palabras clave: Crioconservación, nitrógeno líquido, vitrificación, cultivo in vitro, reguladores de crecimiento,
ápices, semillas, cedro, Cedrela odorata.
Keywords: Cryopreservation, liquid nitrogen, vitrification, in vitro culture, growth regulators, shoots, seeds,
cider, Cedrela odorata.
Recibido: 31/08/12 Aceptado: 04/03/13
RESuMEN AbSTRACT
En busca de proteger el recurso forestal Cryopreservation de of shoots and seeds
de Cedrela odorata L., actualmente amenazado, of cedar (Cedrela odorata L.). In order to protect
se planteó la necesidad de establecer un proto- the forest resources of Cedrela odorata L.,
colo para su crioconservación; la investigación currently threatened, it was considered necessary
se realizó con ápices y semillas. Con los ápices to establish a protocol for its cryopreservation.
se evaluó la técnica de vitrificación a través de Research was conducted using shoots and seeds.
varias soluciones vitrificadoras y congelamiento Vitrification techniques were evaluated with
rápido en nitrógeno líquido (NL). Inicialmente shoots, using various solutions and rapid freezing
los mejores resultados se obtuvieron al evaluar in liquid nitrogen (LN). Initially the best results
la incubación en la solución PVS3 por 5 min were obtained using incubation for 5 min in
antes del congelamiento, con una sobrevivencia PVS3 solution before freezing, survival being
del 61% después de 3 semanas de cultivo en el 61% after 3 weeks of culture on Murashige and
medio Murashige y Skoog (MS) con 1,0 mg.l-1 Skoog (MS) medium with 1.0 mg.l-1 BAP and
BAP y 0,1 mg.l-1 AG . Por otra parte, al incubar 0.1 mg.l-1 GA . Moreover, by incubating the
3 3
los ápices en una solución 0,3 M de sacarosa por apices in 0.3 M sucrose solution for 5 min prior
5 min previo al congelamiento, el porcentaje de to freezing, the survival rate reached 86% after 2
sobrevivencia alcanzó 86% después de 2 semanas weeks of culture on MS medium with 1.0 mg.l-1
de cultivo en un medio MS con 1,0 mg.l-1 BAP, BAP, 0.1 mg.l-1 GA and 0.01 mg.l-1 IAA. When
3
0,1 mg.l-1 AG y 0,01 mg.l-1 AIA. Cuando se utili- incubation in the solution of 0.3 M sucrose was
3
zó la incubación en la solución de 0,3 M sacarosa used and recovery MS medium with 1 mg.l-1
y el medio de recuperación MS con 1 mg.l-1 KIN, KIN, 0.5 mg.l-1 GA and 100 mg.l-1 activated
3
0,5 mg.l-1 AG y 100 mg.l-1 carbón activado, la charcoal, the appearance of the surviving shoots
3
apariencia de los ápices sobrevivientes mejoró improved significantly. For cryopreservation of
considerablemente. Para la criopreservación de cedar seeds, the methodology of dehydration
semillas de cedro, se evaluó el método de des- and rapid freezing in liquid nitrogen (LN) was
hidratación y congelamiento rápido en nitrógeno evaluated. Seeds with moisture content between
líquido (NL). Semillas con un contenido de 7.9% and 5.5% were placed in 5 ml polypropylene
1 Autor para correspondencia. Correo electrónico: * Centro de Investigación en Biotecnología. Escuela
[email protected] de Biología. Instituto Tecnológico de Costa Rica.
Cartago, Costa Rica.
114 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
humedad entre 7,9% y 5,5% fueron colocadas en vials and these were directly immersed in NL.
criotubos de polipropileno de 5 ml y los criotubos The effect of the storage period in NL (1 h, 24
sumergidos directamente en NL. Se evaluó el h, 7 days, 1 month, 3 months and 6 months) on
efecto del periodo de almacenamiento en NL (1 seed germination was evaluated. There were
h, 24 h, 7 días, 1 mes, 3 meses y 6 meses) sobre no statistical differences in ability of seeds to
la germinación de las semillas. No se presentaron germinate after storage during different periods.
diferencias significativas en su capacidad de ger-
minación después de permanecer en los diferen-
tes periodos de almacenamiento.
INTRODuCCIÓN temperatura, las divisiones celulares y los proce-
sos metabólicos se encuentran detenidos, por lo
El germoplasma vegetal constituye uno
que el material vegetal puede ser almacenado sin
de los recursos naturales más importantes y
alteración por un periodo de tiempo teóricamen-
posee un valor incalculable para la humanidad
te ilimitado (González y Engelmann 2006). La
(Poehlmann 2005). Durante la segunda mitad del
crioconservación es especialmente recomendada
siglo XX, la necesidad de conservar los bosques
para la conservación de los recursos fitogenéticos
de las regiones tropicales se volvió cada vez más
de especies recalcitrantes, sensibles a la deseca-
evidente. En los neotrópicos ha habido, y hasta
ción, cuyo potencial para ser conservadas se ve
hoy existen, extensos recursos forestales, pero
limitado al utilizar otras modalidades (Martínez
cada vez están en mayor peligro por el abuso,
et ál. 2003); así como en especies en peligro de
la deforestación irracional y el mal manejo. La
extinción que debido a su escasez o por algún
acelerada deforestación de los bosques naturales
factor particular de su biología, se encuentran
ha llevado a la disminución de individuos que en
gravemente amenazadas de desaparecer (Abdel-
muchos casos eran catalogados como excelentes
nour et ál. 2007). También es especialmente útil
árboles reproductores (Wadsworth 2000); por lo
para la conservación de materiales generados
que esfuerzos para prevenir la erosión genética se
en laboratorio como ápices, meristemos, líneas
han dirigido a conservar las diferentes especies
celulares y callos y para la conservación de ger-
de interés, al tratar de complementar la conserva-
moplasma en general (Dolce et ál. 2004). Dentro
ción in situ con otros métodos de conservación ex
de las técnicas de crioconservación se reconocen
situ como los bancos de semillas, las colecciones
de campo y las colecciones in vitro (Engelmann varios procedimientos, uno de los más utilizados
2011). Dentro de esta última modalidad, la crio- es la vitrificación per se (Engelmann 2000). El
conservación se presenta como una nueva alter- principio del método es deshidratar el explante
nativa que permite almacenar bajo condiciones exponiéndolo a una solución vitrificadora con
de alta estabilidad genética estos importantes alto potencial osmótico por unos cuantos minu-
recursos (García et ál. 2007). La crioconservación tos previo al congelamiento (Sánchez y Jiménez
consiste en el almacenamiento de células vivas y 2010, Wang y Deng 2004). Usualmente se utili-
organismos a ultra bajas temperaturas de -196ºC zan soluciones vitrificadoras a base de glicerol
en nitrógeno líquido (NL) (Engelmann 2011), y las más conocidas son PVS2, PVS3 y PVS4
para la estabilidad genética del germoplasma (Sakai y Engelmann 2007). La solución se súper
en las colecciones (Benson et ál. 2006). A esta enfría por debajo de temperaturas menores a los
Agronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
GARCÍA Y ABDELNOUR: Crioconservación de ápices y semillas de cedro 115
-100°C y finalmente se solidifica en un vidrio laboratorio, debe conservarse de manera segura
metaestable a la temperatura de transición del y por periodos extensos y la crioconservación
vidrio (Sakai y Engelmann 2007). representa un respaldo a futuro de este valioso
Por otra parte, para el almacenamiento germoplasma.
de semillas ortodoxas, la conservación ex situ se El presente estudio pretendió establecer
realiza principalmente en bancos convencionales protocolos para la crioconservación de ápices y
de semillas y si se mantienen con un bajo conte- semillas de cedro (Cedrela odorata L.) mediante
nido en humedad, a bajas temperaturas, teórica- la técnica de vitrificación en ápices, la deshidrata-
mente, el periodo de conservación se incrementa. ción y congelamiento rápido en nitrógeno líquido
Sin embargo, aún en las mejores condiciones de en las semillas. También se evaluó el efecto del
almacenamiento, las semillas sufren una progre- periodo de almacenamiento a ultra baja tempera-
siva pérdida de viabilidad, adicionalmente, estas tura sobre la germinación de las semillas.
semillas pueden ser almacenadas mediante técni-
cas de crioconservación, como un respaldo de las
MATERIALES Y MÉTODOS
colecciones existentes (Cardoso et ál. 2000). En
cuanto al cedro (Cedrela odorata L. Meliaceae),
Establecimiento in vitro del material vegetal
conocido como cedro amargo, si sus semillas se
conservan en condiciones ambientales, su viabi-
Para los primeros ensayos de estableci-
lidad disminuye rápidamente después de un mes,
miento in vitro y crioconservación, las semillas
pero almacenadas adecuadamente se conservan
fueron colectadas del árbol, en marzo del 2008,
por varios meses. Las semillas almacenadas en
de árboles identificados como élite (Santa Cruz,
bolsas de polietileno a 5°C de temperatura y 7%
Guanacaste, Costa Rica) y el procedimiento de
de contenido de humedad, mantienen un porcen-
desinfección para el establecimiento in vitro
taje de germinación de 50 a 60%, a los 2 años.
consistió en el lavado de las semillas con deter-
Por su resistencia al almacenamiento se considera
gente (Bactex®) seguido de 3 enjuagues con agua
una especie ortodoxa. La semilla se conserva
estéril, luego de la incubación en una solución de
bien por lo menos 9 meses a una temperatura
NaOCl al 3,5% i.a., por 10, 15 y 20 min y por últi-
de 2 a 3ºC, esté o no herméticamente envasada.
mo, las semillas fueron enjuagadas 3 veces con
El mejor registro de almacenamiento muestra el
agua destilada estéril y cultivadas en el medio
86% de viabilidad de las semillas después de 304 MS (Murashige y Skoog 1962) con 0,5 mg.l-1 de
días de estar almacenadas a 2ºC de temperatura y
benciladenina (BA).
4% de contenido de humedad (Díaz et ál. 2010). Los siguientes ensayos para el estableci-
Cedrela y sus demás especies se considera una de miento in vitro y crioconservación de semillas
las maderas comerciales más preciosas e impor- se hicieron con semillas proporcionadas por el
tantes de América Latina, en especial Cedrela Banco de Semillas Forestales del Centro Agro-
odorata (Díaz et ál. 2010). Esto ha ocasionado nómico Tropical de Investigación y Enseñanza
que esté sometida a grandes presiones por su (BSF-CATIE). Las semillas venían en empaques
extracción. Uno de los mayores problemas del sellados y habían recibido un tratamiento de
cedro es el taladrador de las meliáceas, Hypsipyla desecación previo, para permitir su almacena-
grandella Zeller; cuyo ataque se intensifica en miento a temperaturas cercanas a los 4°C. Según
los árboles que crecen en plantaciones comer- el certificado otorgado por el BSF-CATIE el
ciales. Estas razones evidencian la necesidad de porcentaje de humedad de las semillas era de
evaluar y establecer métodos para preservar el 5,5%. Se evaluaron 2 lotes, el primero fue CATIE
material valioso remanente de cedro (Díaz et ál. 058/08J (colectadas del árbol en el primer tri-
2010, Howard y Merida 2004, Navarro 2002). mestre de 2008), con una pureza de 95% y un
Todo material de estas especies, generado en porcentaje de germinación de 92%. El segundo
Agronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
116 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
lote CATIE 058/09K (colectadas del árbol en el adicionaron otros reguladores como AG (ácido
3
2009) también presentó un porcentaje de pureza giberélico)(0,1 mg.l-1) y AIA (ácido indolacético)
del 95% pero un porcentaje de germinación de (0,01 mg.l-1). Los ápices en medio de regenera-
60%. Ambos lotes de semillas procedentes de ción se mantuvieron bajo condiciones de oscuri-
Pococí, Limón, Costa Rica; de una fuente iden- dad la primera semana, luego fueron transferidos
tificada de un bosque natural. Las semillas se una semana a luz difusa y posteriormente en luz
pre-seleccionaron, aquellas que para las pruebas, directa. Las condiciones de crecimiento fueron
presentaban una coloración café clara o parda. de 25ºC ± 2 y un fotoperiodo de 16 horas luz,
Se descartaron las semillas café oscuro y negras, con una intensidad lumínica de 3000 lux. Se
ya que en ensayos preliminares se determinó que consideraron como sobrevivientes los ápices que
estas habían perdido su capacidad de germina- permanecieron verdes y los que regeneraron con
ción. Para el establecimiento in vitro se siguió el nuevas hojas.
procedimiento de desinfección descrito arriba, Durante la etapa de pretratamiento (acon-
previa incubación en una solución de Agri- dicionamiento para el proceso congelación), los
mycin®, Benlate®, Ferbam® en una concentra- ápices aislados fueron precultivados por 24 h, en
ción de 5 g.l-1 de cada uno por 30 min, seguido el medio de cultivo MS con sacarosa, sola o en
de 15 min en la solución de NaClO al 3,5% i.a. combinación con glicerol (0,3 M sacarosa, 0,3
La inducción de la germinación se realizó en el M sacarosa + 1 M glicerol, 0,5 M sacarosa, 0,5
medio MS (Murashige y Skoog 1962) enrique- M sacarosa + 1 M glicerol). Los cultivos se man-
cido con 0,5 mg.l-1 BAP. Para su multiplicación tuvieron en oscuridad para evitar su oxidación,
(cerca de 5 semanas después de la introducción), a una temperatura de 20°C ± 2 durante las 24 h;
cuando las plántulas presentaban varios nudos, se posteriormente los ápices fueron transferidos al
segmentaron en microestacas de 1 a 2 nudos y se medio de regeneración para evaluar así el efecto
cultivaron en el medio MS con 0,5 g.l-1 caseína del precultivo en la recuperación y elegir el mejor
hidrolizada y 1 mg.l-1 de BA.
proceso a utilizar en etapas posteriores.
Una vez conocidas las mejores condicio-
Crioconservación de ápices
nes de pretratamiento, se procedió a realizar el
Para iniciar los ensayos de crioconserva- protocolo de vitrificación y el congelamiento en
ción, las plantas germinadas y desarrolladas in NL (Sakai y Engelmann 2007). En criotubos de
vitro fueron multiplicadas. Una semana después de polipropileno de 1,2 ml, los ápices provenientes
la multiplicación, los ápices axilares fueron disec- del precultivo fueron incubados en 1 ml de la
tados y sometidos a diferentes tratamientos del solución de carga (LS, MS + 0,4 M sacarosa +
proceso de pre y post congelamiento en NL. Para 2 M glicerol); después de 20 min, la solución
evaluar la regeneración (recuperación) de los ápices fue reemplazada por la solución vitrificadora
se empleó el medio MS mediante modificación de a evaluar: PVS2 (MS + 0,4 M sacarosa + 30%
las concentraciones de reguladores del crecimien- v/v glicerol + 15% v/v etilenglicol + 15% v/v
to en el transcurso de las pruebas, con el fin de DMSO [dimetil sulfóxido]), PVS3 (MS + 50%
optimizar los resultados. Inicialmente se empleó v/v glicerol + 50% m/v sacarosa) y PVS4 (MS +
un MS con 0,5 mg.l-1 de BAP. En las siguientes 0,6 M sacarosa + 35% v/v glicerol + 20% v/v eti-
pruebas se evaluó el BAP en concentraciones de lenglicol), todas durante periodos de 5 y 10 min.
0, 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 mg.l-1; con la colocación de Pasado el periodo de incubación, los crioviales
papel filtro (Whatman #100) sobre la superficie con los ápices y la solución vitrificadora fueron
del medio sólido, para facilitar la manipulación de introducidos rápidamente en NL donde perma-
los explantes. A partir de estos ensayos se continuó necieron cerca de 17 h. Se descongelaron en un
con el medio MS de 1,0 mg.l-1 BAP como medio baño de agua a 40°C durante 2 min e inmedia-
base de recuperación de los ápices y a este se tamente se eliminó la solución vitrificadora y se
Agronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
GARCÍA Y ABDELNOUR: Crioconservación de ápices y semillas de cedro 117
adicionó 1 ml de la solución de lavado (MS +1,2 de ápices sobrevivientes así como el número de
M sacarosa) por 5 min. Para su recuperación, los ápices regenerados del total de sobrevivientes.
ápices fueron cultivados en el medio de regenera- Estos resultados fueron sometidos al análisis de
ción (MS + 1,0 mg.l-1 BAP + 0,1 mg.l-1 AG ,con varianza y prueba de significación Tukey con un
3
papel filtro) bajo las condiciones ya señaladas. nivel de significancia de 0,05 cuando se deter-
Adicionalmente se realizaron ensayos minó la existencia de diferencias significativas
mediante la incubación antes del congelamiento con el ANOVA. Además de los resultados cuanti-
rápido en NL, en 4 soluciones diferentes para tativos se consideraron también las características
la crioconservación: MS + 0,3 M sacarosa, MS cualitativas o morfológicas de los ápices (color y
+ 0,3 M sacarosa + 5% v/v DMSO, MS + 0,4 apariencia general de los ápices).
M sacarosa y MS +0,4 M sacarosa + 5% v/v
Crioconservación de semillas
DMSO; ápices incubados por 5 y 10 min. El
medio de precultivo empleado en cada caso tuvo
Para los ensayos iniciales de crioconserva-
la misma composición de la solución líquida,
ción, se determinó el contenido de humedad de las
pero en estado sólido; así, por ejemplo, cuando
semillas (coloración café clara o parda), con base
se precultivaron en el MS (sólido) + 0,3 M saca-
en el peso fresco y seco (ISTA 2008). Grupos de
rosa, la solución empleada también fue un MS
50 semillas, de cada periodo de deshidratación
(líquido) + 0,3 M sacarosa. Dicho tratamiento fue
evaluado (0 a 5 h en el flujo de aire de la cámara
el empleado para el proceso de congelamiento. El
de transferencia de flujo laminar), fueron coloca-
medio de regeneración en estos últimos ensayos
das en criotubos de polipropileno de 5 ml y con-
fue MS + 1,0 mg.l-1 BAP + 0,1 mg.l-1 AG + 0,01
3 geladas rápidamente por inmersión en nitrógeno
mg.l-1 AIA, con papel filtro sobre la superficie del
líquido, donde permanecieron una hora. Luego,
medio de cultivo. las muestras fueron descongeladas por inmersión
Finalmente, la investigación se direc- de los criotubos en un baño de agua a 40ºC por
cionó a evaluar la crioconservación por medio 2 min (Abdelnour et ál. 2007) y cultivadas en el
de la solución MS + 0,3 M sacarosa y dife- medio de cultivo MS con 0,5 mg.l-1 de BA para
rentes medios de regeneración, enriquecidos su recuperación. Para estos ensayos iniciales de
con diversos reguladores de crecimiento y su crioconservación, se evaluó la desinfección de las
combinación (BAP: bencialaminopurina, KIN: semillas antes y después del congelamiento en
kinetina, TDZ: tidiazuron, AG3 ácido giberélico) NL, éste último para evitar la rehidratación de la
así como la adición de otros compuestos como semilla antes del congelamiento.
carbón activado. Una vez seleccionados los Adicionalmente, se determinó la sobre-
medios que permitieron la mayor sobrevivencia vivencia y germinación de semillas de cedro
y regeneración de los ápices congelados M1 (MS después de ser almacenadas por varios periodos
+ 1 mg.l-1 BAP + 0,1 mg.l-1 AG + 0,01 mg.l-1 en NL (1 h, 24 h, 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6
3
AIA + 100 mg.l-1 carbón activado) y M2 (MS meses). El material experimental para estas prue-
+ 1 mg.l-1 KIN + 0,5 mg.l-1 AG + 100 mg.l-1 bas se obtuvo del Banco de Semillas Forestales
3
carbón activado), pasado el periodo de almace- de CATIE (BSF-CATIE). Las semillas venían
namiento en NL, los ápices se transfirieron cada en empaques sellados y habían recibido un tra-
día o cada 2 días a medio fresco en oscuridad y tamiento de desecación previo, para permitir su
una semana después a luz directa. almacenamiento a temperaturas cercanas a los
En todos los tratamientos se establecie- 4°C. Según el certificado otorgado por el BSF-
ron 2 o 3 repeticiones de 15 ápices cada una. CATIE el porcentaje de humedad de las semillas
Las evaluaciones de las pruebas se realizaron era de 5,5%. Para estos ensayos, las semillas fue-
cada semana, durante un número de semanas ron colocadas en crioviales (tubos de polipropile-
variable. En todos los casos, se anotó el número no de 5 ml), en grupos de 30 semillas por criovial
Agronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
118 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
e inmediatamente fueron congeladas por inmer- los días este porcentaje disminuyó y los ápices
sión en un tanque de almacenamiento con NL. que lograron regenerar murieron al poco tiempo
Para cada tratamiento se hicieron 3 repeticiones. (Datos no se muestran).
Una vez concluido cada uno de estos periodos de
Crioconservación de ápices
almacenamiento, se extrajeron los crioviales con
las semillas e inmediatamente se introdujeron
Cuando se trató de mejorar los índices de
en un baño de agua a 40°C por 2 min para su
sobrevivencia y regeneración de los ápices para
descongelación. Posteriormente, se procedió a
iniciar los ensayos de crioconservación, de los
realizar el procedimiento de desinfección de las
5 tratamientos evaluados (MS, MS + 0,5 mg.l-1
semillas, a partir del protocolo descrito previa-
BAP, MS + 1,0 mg.l-1 BAP, MS + 1,5 mg.l-1 BAP
mente en la sección de establecimiento in vitro
y MS + 2,0 mg.l-1 BAP, cada uno con y sin papel
del material vegetal. De igual forma se siguieron
filtro), los mayores porcentajes de sobrevivencia
las demás especificaciones del proceso de intro-
y regeneración se obtuvieron cuando se colocó
ducción de las semillas.
papel filtro sobre la superficie del medio sólido.
Dentro de este grupo, los mayores porcentajes
RESuLTADOS de sobrevivencia fueron observados en el MS +
1,0 mg.l-1 BAP, con 100% de sobrevivencia en
la semana 1, y fue el tratamiento que, a lo largo
Establecimiento in vitro del material vegetal
de las 5 semanas de evaluación mantuvo los por-
El porcentaje de germinación in vitro de las centajes más altos de sobrevivencia (83% y 73%
semillas alcanzó el 100%, después de 2 semanas a la tercera y quinta semana de cultivo respec-
de cultivo (indistinto del origen y siempre que se tivamente), además, la apariencia de los ápices
seleccionaron las semillas), tanto en el medio MS fue la mejor (verdes y sin hiperhidratación). En
con 0,5 mg.l-1 de BA como en ausencia de BA. todos los medios evaluados, durante la semana
La desinfección con NaOCl al 3,5% i.a., durante 1 ya se notaban indicios de regeneración y para
15 min permitió el establecimiento aséptico del la semana 5 la mayoría de los ápices sobrevi-
material (97%). Por otra parte, aquellas semillas vientes presentaron entre 2 y 4 hojas. Para los
cultivadas en el medio MS simple mostraron cre- medios sin papel, aunque hubo sobrevivencia
cimiento vigoroso y desarrollo de raíces y mejor y también regeneración, el número de hojas no
aspecto general que aquellas cultivadas en la pre- superó las 2 por ápice. En los medios de cultivo
sencia de BA (0,5 mg.l-1) en el medio de cultivo con concentraciones de BAP mayores a 1 mg.l-1,
(Datos no se muestran). En la etapa de multipli- los ápices presentaron apariencia vidriosa y colo-
cación, cuando el medio de cultivo se enriqueció ración amarillenta, lo que también fue observado
con 0,5 g.l-1 de caseína hidrolizada como fuente frecuentemente en los medios sin papel filtro,
adicional de nitrógeno, se observó el desarrollo aún en presencia de concentraciones menores de
de plántulas con un buen sistema radicular y un la citocinina.
aspecto general saludable, hojas grandes y verdes. Ya en la fase de pretratamiento, (Figura
Cuando a este medio se adicionó BA (1,0 a 2,0 1), cuando los ápices fueron inoculados en los
mg.l-1) para estimular la brotación de las yemas medios de precultivo por 24 h y luego transfe-
axilares y facilitar la disección de los ápices, ridos al de regeneración para la evaluación de
se observó caída de hojas y hiperhidricidad en su respuesta durante las semanas posteriores al
los tejidos. Resultados similares se observaron ensayo, la mayor sobrevivencia se observó con
durante la regeneración de los ápices disectados el tratamiento MS + 0,3 M sacarosa por 24 h,
cuando se utilizó este mismo medio de cultivo. con 56% de sobrevivencia después de 4 sema-
Aunque durante la primera semana la sobreviven- nas de cultivo. Le siguió el medio con 0,5 M de
cia en este medio fue buena, conforme pasaron sacarosa (alrededor del 25% de sobrevivencia).
Agronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
GARCÍA Y ABDELNOUR: Crioconservación de ápices y semillas de cedro 119
Fig. 1. Sobrevivencia de los ápices de cedro (Cedrela odorata) expuestos a diferentes medios de precultivo por 24 h, como
pretratamiento antes del congelamiento en nitrógeno líquido posteriormente cultivados en medio de regeneración
MS + 0,5 mg.l-1 BAP por 4 semanas.
Al adicionar a dichos medios 1 M de glicerol se PVS3 y la PVS4 por 10 min, con porcentajes de
redujo drásticamente la sobrevivencia de los ápi- sobrevivencia superiores al 90%; mientras que
ces, al llegar incluso, a un 0% a la cuarta semana los ápices incubados en PVS3 y PSV4 durante
de precultivo. La sobrevivencia y la regeneración 5 min presentaron valores inferiores al 80%.
se llevó a cabo con el cultivo en el medio MS+0,5 Esto evidencia que posterior al congelamiento
mg.l-1 BAP y la regeneración se presentó en la el material logró sobrevivir y los tratamientos
semana 3 de cultivo. Según la tendencia anterior, siguientes deben enfocarse en evitar que mueran
el mayor porcentaje de regeneración de los ápices y lleguen a regenerar en plántulas completas. Este
sobrevivientes al precultivo se presentó en aque- comportamiento se invirtió al final de la segun-
llos precultivados en el medio con 0,3 M sacarosa da semana, ya que estos 2 últimos tratamientos,
(57%), seguido por el tratamiento de precultivo en mostraron la mayor sobrevivencia, con 61 y 57%
0,5 M sacarosa (20%). En los medios con glice- respectivamente. Por otro lado, con la incubación
rol, de los pocos ápices verdes observados antes en PVS2 los porcentajes de sobrevivencia decre-
de la cuarta semana de cultivo, ninguno llegó a cieron notablemente en la segunda semana, donde
regenerar. Con estos ensayos se logró establecer los tratamientos con los menores porcentajes de
el mejor tratamiento de precultivo para poder sobrevivencia son de alrededor de 40%. Median-
continuar con los pasos siguientes del protocolo te un ANOVA se determinó que para la primera
para la crioconservación. semana, no existieron diferencias significativas
Al evaluar el efecto de la incubación en las entre los tratamientos NL+ (sometidos a NL).
soluciones vitrificadoras PVS2, PVS3 y PVS4, Sin embargo, los mejores resultados obtenidos a
durante 5 y 10 min, seguido del congelamiento lo largo de la evaluación, bajo las condiciones de
en NL (Cuadro 1), se observó que los tratamien- este ensayo (no sólo basados en datos cuantita-
tos que mostraron los mayores porcentajes de tivos sino también en la apariencia del material
sobrevivencia, después de la primera semana de evaluado), se lograron al emplear la PVS3 por 5
cultivo en el medio de recuperación fueron la min; donde la apariencia de los ápices fue nota-
incubación en PVS2 por 5 y 10 min, así como la blemente la mejor.
Agronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
120 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
Cuadro 1. Sobrevivencia de los ápices de cedro (Cedrela odorata) al congelamiento en nitrógeno líquido (NL) después de la
incubación en las soluciones vitrificadoras PVS2, PVS3 y PVS4 por periodos de 5 y 10 min y cultivados en el medio
MS + 1,0 mg.l-1 BAP + 0,1 mg.l-1 AG con papel filtro, por 2 semanas.
3
Sobrevivencia ápices crioconservados (% ± E. E.)*
Solución vitrificadora
Semana 1 Semana 2
Tratamiento 5 min 10 min 5 min 10 min
PVS 2 92,36±1,12 95,40±2,39 42,13±1,85 38,41±1,76
PVS 3 79,63±1,94 94,29±3,72 60,65±2,18 50,00±3,00
PVS 4 75,76±2,30 90,37±3,01 56,87±4,20 44,44±3,07
*Cada valor representa un valor promedio de 3 repeticiones con 10-12 ápices por repetición. E. E.= Error Estándar. No se
encontraron diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (ambos tiempos) dentro de la misma semana de
evaluación al emplear las 3 soluciones vitrificadoras (p=0,05).
En el último ensayo de vitrificación (con y 0,3 M sacarosa + 5% DMSO durante 5 min,
las 4 soluciones basadas en MS con diferentes se mantuvo bastante alta (cerca del 86% y 80%
concentraciones de sacarosa y DMSO) (Cua- respectivamente), sin embargo; en esta semana, la
dro 2), después de una semana de cultivo en sobrevivencia disminuyó considerablemente para
el medio de recuperación, se observaron altos los ápices incubados en la solución con 0,4 M
porcentajes de sobrevivencia de los ápices para sacarosa + 5% DMSO por 5 y 10 min (40% y 23%
ambos periodos evaluados, presentándose los respectivamente). El ANOVA mostró diferencias
mayores porcentajes para los tratamientos con altamente significativas entre tratamientos (99%
0,3 M sacarosa, 0,3 M sacarosa + 5% DMSO de confianza), al ser el mejor tratamiento, la
y 0,4 M sacarosa por 5 min (superior al 90%). incubación en el medio con 0,3 M sacarosa por 5
En la segunda semana, el porcentaje de sobrevi- min, antes del congelamiento en NL (93 y 86%,
vencia para los tratamientos con 0,3 M sacarosa semana 1 y 2 respectivamente).
Cuadro 2. Sobrevivencia de los ápices de Cedrela odorata (cedro) al congelamiento en nitrógeno líquido (NL) utilizando 4 solu-
ciones vitrificadoras con sacarosa y sacarosa + DMSO y 2 periodos de incubación, 5 y 10 min, previo al congelamien-
to. El medio de recuperación fue el MS + 1,0 mg.l-1 BAP + 0,1 mg.l-1 AG + 0,01 mg.l-1 AIA con papel, por 2 semanas.
3
Sobrevivencia ápices crioconservados (% ± E. E.)*
Solución vitrificadora
Semana 1 Semana 2
Tratamiento 5 min 10 min 5 min 10 min
MS + 0,3 M sacarosa 93,34±1,74 b1 83,96±2,36 c 85,60±1,82 a 63,96±2,63 bc
MS + 0,4 M sacarosa 75,60±3,92 d 92,86±2,81 b 53,57±2,53 d 67,62±2,53 b
MS + 0,3 M sacarosa + 5%DMSO 94,12±2,14 ab 81,09±4,57 cd 74,70±2,08 b 59,28±2,01 c
MS + 0,4 M sacarosa + 5%DMSO 96,66±1,55 a 54,54±3,88 e 41,66±1,36 e 22,50±2,63 f
*Cada valor representa un valor promedio de 3 repeticiones con 10-12 ápices por repetición. E. E.= Error Estándar.
1Letras distintas indican diferencias significativas en el porcentaje de sobrevivencia en todos los tratamientos, dentro de una
misma semana de evaluación (p<0,05).
Agronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
GARCÍA Y ABDELNOUR: Crioconservación de ápices y semillas de cedro 121
En los ensayos iniciales para la regene- Crioconservación de semillas
ración de los ápices sobrevivientes al congela-
Las semillas provenientes de campo (Santa
miento, al evaluar el efecto de varios medios de
Cruz, Guanacaste), que presentaron un contenido
regeneración, después de la crioconservación con
el uso de solución vitrificadora, el medio MS + de humedad alrededor de 7,9% mostraron los
0,3 M de sacarosa mostró que el TDZ en cedro mayores porcentajes de germinación que varia-
aún en bajas concentraciones, indujo la formación ron del 97% al 100%, tanto las semillas control
excesiva de callo. Por otra parte, el BAP, pero sin congelar, como las congeladas. Lo que indica
sobre todo la KIN dieron resultados satisfacto- que la metodología utilizada para la criocon-
rios (no ocurrió vitrificación ni formación de servación de cedro es efectiva. El porcentaje de
callos, se observó indicios de respuesta como la germinación de las semillas congeladas después
aparición de hojas nuevas en un 46% del material de la desinfección y congeladas antes de la des-
posterior a 21 días de cultivo). El uso de AG infección no mostró diferencias estadísticamente
3
en combinación con estas 2 últimas citocininas significativas, sin embargo, aquellas semillas
resultó en un mejor desarrollo de los ápices (57% desinfectadas después del congelamiento presen-
de ellos se mantuvieron vivos, con hojas nuevas taron mayor vigorosidad y coloración verde más
a los 21 días y aumento en su tamaño). Según las intensa que las desinfectadas antes del congela-
pruebas estadísticas empleadas en este estudio, no miento en NL (Datos no se muestran).
hubo diferencia significativa entre los resultados, Cuando las semillas provenientes del BSF
sin embargo; de manera cualitativa se observó fueron congeladas y almacenadas en NL por
mejor coloración, tamaño y número de las hojas, varios periodos, se observó que la duración del
niveles de oxidación (resultados no se muestran) almacenamiento no tuvo gran efecto negativo
en la recuperación al usar el M2 (MS + 1 mg.l-1 sobre su capacidad de germinación (Cuadro
KIN + 0,5 mg.l-1 AG + 100 mg.l-1 carbón activa- 3). La evaluación de los resultados se realizó
3
do) con respecto al medio denominado M1 (MS + semanalmente hasta la 5 semana después de la
1 mg.l-1 BAP + 0,1 mg.l-1 AG + 0,01 mg.l-1 AIA descongelación y el cultivo en el medio de rege-
3
+ 100 mg.l-1 carbón activado). neración, ya que conforme aumentó el tiempo
Cuadro 3. Germinación de semillas de cedro (Cedrela odorata L.) después de la congelación y almacenamiento en nitrógeno
líquido (NL) durante varios periodos.
Germinación de semillas (% ± E. E.)*
Tiempo de almacenamiento
Semanas de cultivo
en NL
1 3 5
Control sin congelar 93,71±3,08 100,00±0,00 100,00±0,00
1 h 92,30±6,85 100,00±0,00 100,00±0,00
24 h 85,25±8,38 100,00±0,00 100,00±0,00
7 días 92,85±7,75 100,00±0,00 100,00±0,00
1 mes 83,62±11,62 95,60±1,52 96,20±0,91
3 meses 86,88±8,10 94,48±1,89 94,92±2,60
6 meses 84,66±7,93 92,80±3,49 94,60±2,71
*Cada valor representa un valor promedio de 3 repeticiones con 30 semillas por repetición. E. E.= Error Estándar. El ensayo se
repitió 2 veces. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (p=0,05).
Agronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
122 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
de almacenamiento, el tiempo requerido para la de algunas especies maderables durante la etapa
germinación de las semillas se incrementó (en de elongación y multiplicación (Abdelnour et ál.
promedio 2 días más, esto respecto al inicio de 2011, Gamboa y Abdelnour 1999) y el cedro en
la germinación al darse ruptura de la semilla y esta investigación. A la vez se menciona que la
visualización de la raíz [datos no se muestran]) caseína hidrolizada ayuda a promover la activa-
aunque al cabo de los 7 días de su cultivo (pri- ción de yemas y el crecimiento de las plantas
mera evaluación) la mayoría había germinado en cultivadas in vitro, como resultado de suminis-
todos los casos. Así, el análisis de varianza mos- trar extra calcio, fósforo y micronutrientes y se
tró que no se presentaron diferencias estadística- menciona que es fuente importante de nitrógeno
mente significativas entre los tratamientos, sin reducido en forma de aminoácidos, lo que parece
embargo; cabe resaltar que el ensayo se realizó en explicar la apariencia verde y vigorosa de las
2 ocasiones con 2 lotes de semillas diferentes. En plantas durante la multiplicación (George et ál.
ambos casos el comportamiento de las plántulas 2008, Reyes y Vera 2004, Pérez et ál. 2001).
regeneradas a partir de las semillas fue similar, Por otra parte, el BAP en concentraciones
pero la germinación de las semillas procedentes mayores a 1,0 mg.l-1 afectó negativamente el
del segundo lote resultó menor, pero hay que material vegetal de cedro (caída de hojas e hiper-
considerar que para estas se reportó un porcentaje hidratación). Al igual que en este estudio, Pérez et
de germinación de tan solo 60% antes de la selec- ál. (2001), encontraron que las bajas concentracio-
ción de las semillas por color, por lo que ya de nes de BAP fueron más eficaces para promover la
previo era de esperar un resultado inferior de este brotación de los explantes nodales de esta especie.
parámetro. Esto evidenció la necesidad de utilizar Adicionalmente, Collado et ál. (2004), informaron
material de partida de calidad para garantizar el sobre un efecto similar del BA en bajas concentra-
éxito de los resultados. ciones (0,25 mg.l-1 ó 0,2 mg.l-1), para la elongación
de las plántulas de caoba (Swietenia macrophylla
King) provenientes de semillas germinadas in
DISCuSIÓN
vitro. Se han planteado numerosas hipótesis diri-
Los altos porcentajes de germinación de gidas a explicar la causa de las alteraciones gene-
las semillas y la apariencia vigorosa de las radas por la hiperhidratación de brotes, fenómeno
plántulas generadas demostraron que el medio descrito como un desorden fisiológico caracteri-
empleado fue el adecuado. El empleo de un zado por la apariencia vidriosa e hinchada de los
medio sencillo (sin reguladores) permitió la ger- tejidos, tallos turgentes y órganos translúcidos y
minación de las semillas de cedro, ya que el quebradizos y una de las razones que se mencio-
endospermo provee al embrión de los nutrientes nan es la presencia de altas concentraciones de
y reguladores de crecimiento requeridos para su reguladores de crecimiento como BAP, ABA,
germinación y desarrollo inicial (Flores-Vindas AIA en el medio de cultivo (Sánchez y Jiménez
1999). Para el desarrollo posterior y la multiplica- 2010, Afanador 2005).
ción de las plántulas por microestacas, segmentos En el presente estudio, dado el efecto de
de tallo con 1 o 2 brotes, el uso de citocininas hiperhidricidad provocado por altas concentra-
tampoco fue indispensable. Durante esta etapa, ciones de BAP en el cedro, en la etapa de recu-
se obtuvieron buenos resultados en el mismo peración y regeneración de ápices fue un punto
medio de cultivo (MS) y con la adición de caseína importante a considerar. Sin embargo, la adición
hidrolizada, se evitó el amarillamiento y caída de citocininas y otros reguladores del crecimien-
de las hojas. Se menciona que en muchos medios to fue indispensable para la regeneración de los
para el establecimiento y multiplicación in vitro ápices congelados en NL. El medio de cultivo
se utilizan citocininas (Reyes y Vera 2004), pero empleado inicialmente para la regeneración de
algunas especies no lo requieren, como es el caso los ápices, suplementado con 0,5 mg.l-1 BAP, no
Agronomía Costarricense 37(1): 113-126. ISSN:0377-9424 / 2013
Description:ápices, semillas, cedro, Cedrela odorata. Keywords: Cryopreservation, liquid nitrogen, vitrification, in vitro culture, growth regulators, shoots, seeds,.
