Appendix 1 - Papyrus - Université de Montréal

284 Pages·2012·10.43 MB·English

Université de Montréal

The Development, Validation and Implementation of a
Broad-Based ADME Genotyping Assay into Research and
Clinical Trials

Par

Andrew M.K. Brown

Programme de sciences Biomédicales
Faculté de Médecine

Thèse présentée à la Faculté de Médecine
en vue de l’obtention du grade de Ph.D
en Sciences Biomédicales

Décembre, 2011

© Andrew Brown, 2011
Université de Montréal
Faculté des études supérieures et postdoctorales

Cette thèse intitulée:

The Development, Validation and Implementation of a Braod-Based ADME Genotyping Assay
into Research and Clinical Trials

Présenté par :
Andrew M.K. Brown

a été évalué par un jury composé des personnes suivantes :

Dr. Martin Sirois, président-rapporteur
Dr. Michael S. Phillips, directeur de recherche
Dr. Jean-Claude Tardif, co-directeur
Dr. Tomi Pastinen, membre du jury
Dr. Denis Grant, examinateur externe
Dr. Bruce Allen, représentant du doyen de la FES
iii

Résumé
Afin d’adresser la variabilité interindividuelle observée dans la réponse
pharmacocinétique à de nombreux médicaments, nous avons créé un panel de génotypage
personnalisée en utilisant des méthodes de conception et d’élaboration d’essais uniques. Celles-ci
ont pour but premier de capturer les variations génétiques présentent dans les gènes clés
impliqués dans les processus d'absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion
(ADME) de nombreux agents thérapeutiques. Bien que ces gènes et voies de signalement sont
impliqués dans plusieurs mécanismes pharmacocinétiques qui sont bien connues, il y a eu
jusqu’à présent peu d'efforts envers l’évaluation simultanée d’un grand nombre de ces gènes
moyennant un seul outil expérimental. La recherche pharmacogénomique peut être réalisée en
utilisant deux approches: 1) les marqueurs fonctionnels peuvent être utilisés pour présélectionner
ou stratifier les populations de patients en se basant sur des états métaboliques connus; 2) les
marqueurs Tag peuvent être utilisés pour découvrir de nouvelles corrélations génotype-
phénotype. Présentement, il existe un besoin pour un outil de recherche qui englobe un grand
nombre de gènes ADME et variantes et dont le contenu est applicable à ces deux modèles
d'étude. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé un panel d’essais de génotypage de
3,000 marqueurs génétiques ADME qui peuvent satisfaire ce besoin. Dans le cadre de ce projet,
les gènes et marqueurs associés avec la famille ADME ont été sélectionnés en collaboration avec
plusieurs groupes du milieu universitaire et de l'industrie pharmaceutique. Pendant trois phases
de développement de cet essai de génotypage, le taux de conversion pour 3,000 marqueurs a été
amélioré de 83% à 97,4% grâce à l'incorporation de nouvelles stratégies ayant pour but de
surmonter les zones d'interférence génomiques comprenant entre autres les régions homologues
et les polymorphismes sous-jacent les régions d’intérêt. La précision du panel de génotypage a
iv

été validée par l’évaluation de plus de 200 échantillons pour lesquelles les génotypes sont connus
pour lesquels nous avons obtenu une concordance > 98%. De plus, une comparaison croisée
entre nos données provenant de cet essai et des données obtenues par différentes plateformes
technologiques déjà disponibles sur le marché a révélé une concordance globale de > 99,5%.
L'efficacité de notre stratégie de conception ont été démontrées par l'utilisation réussie de cet
essai dans le cadre de plusieurs projets de recherche où plus de 1,000 échantillons ont été testés.
Nous avons entre autre évalué avec succès 150 échantillons hépatiques qui ont été largement
caractérisés pour plusieurs phénotypes. Dans ces échantillons, nous avons pu valider 13 gènes
ADME avec cis-eQTL précédemment rapportés et de découvrir et de 13 autres gènes ADME
avec cis eQTLs qui n'avaient pas été observés en utilisant des méthodes standard. Enfin, à l'appui
de ce travail, un outil logiciel a été développé, Opitimus Primer, pour aider pour aider au
développement du test. Le logiciel a également été utilisé pour aider à l'enrichissement de cibles
génomiques pour d'expériences séquençage. Le contenu ainsi que la conception, l’optimisation et
la validation de notre panel le distingue largement de l’ensemble des essais commerciaux
couramment disponibles sur le marché qui comprennent soit des marqueurs fonctionnels pour
seulement un petit nombre de gènes, ou alors n’offre pas une couverture adéquate pour les gènes
connus d’ADME. Nous pouvons ainsi conclure que l’essai que nous avons développé est et
continuera certainement d’être un outil d’une grande utilité pour les futures études et essais
cliniques dans le domaine de la pharmacocinétique, qui bénéficieraient de l'évaluation d'une
longue liste complète de gènes d’ADME.
Mots-clés : La pharmacogénomique, la pharmacocinétique, ADME, le génotypage, le
développement technologique
v

Abstract
In order to better assess the inter-individual variability observed in a patient’s
pharmacokinetic response to many medications, we have created a custom genotyping panel that
uses unique assay designs to analyze variation present in key genes involved in the absorption,
distribution, metabolism and excretion (ADME) of many therapeutic agents. These genes and
pathways involved in most pharmacokinetic mechanisms are well known. However, as yet, there
has been little effort to develop tools that can interrogate a large number of variations in most
known drug metabolizing genes simultaneously within a single experimental tool.
Pharmacogenomic research has historically been conducted using two approaches: targeted
studies that screen a small number of specific functional markers to identify known metabolic
status phenotypes, and genome-wide studies that identify novel genetic correlations with drug
response phenotypes. Thus, a gap currently exists for a targeted ADME research tool that can
evaluate a large number of key ADME genes and variants in a format that can be applicable to
both types of study designs. As part of this thesis, we have developed a 3000 SNP broad based
ADME genotyping panel that can address this need.
Genes and markers for the genotyping panel were selected in collaboration with many
groups from both academia and the pharmaceutical industry in an effort to capture all pertinent
genes and metabolic pathways that have been implicated in drug metabolism. The final assay
design was composed of over 3000 markers in 181 genes. Over three phases of iterative
development, the assay conversion rate for the 3000 markers was improved from 83.0% to
97.4% through the incorporation of novel design strategies to overcome areas of genomic
interference such as regions of homology and underlying polymorphisms. Accuracy of the assay
was validated by screening more than 200 samples of known genotype with a concordance of
vi

99%. Additionally, data from the assay has also been compared to data from different
technological platforms and has an overall concordance of 99.5%. The effectiveness of the
design strategy was demonstrated in the successful utilization of the assay in the screening of
over 1000 samples which identified several novel pharmacogenetic associations between ADME
variations and adverse drug reactions in children. Another goal of this thesis was to demonstrate
what added benefit/utility the 3000 SNP ADME panel would have when compared to currently
available genotyping assays. Using 150 extensively investigated liver samples, the broad based
assay was not only able to detect and validate 13 previously reported cis eQTLs in ADME genes
but further identified an additional 13 novel ADME cis eQTLs that had never been observed
before, doubling the number previously identified using standard methods on the same samples.
Finally, in support of this work, a number of bioinformatic tools had to be developed to help
expedite this research. These tools have been further refined and are currently being used to
assist with enrichment of genomic targets for next generation sequencing experiments.
In conclusion, this work has led to a better understanding of ADME genetics and the
nuances of assaying ADME genes. The content and designs of the developed assay sets it apart
from currently available commercial assays that contain only functional markers in a small
number of genes or do not have adequate coverage across ADME genes. The assay has the
ability to play a significant role in pharmacogenomic studies to identify known and novel
pharmacogenomic biomarkers. These will lead to improved biomarkers that will help better
stratify pharmaceutical clinical trial populations or assist physicians to select better, more
personalized, efficacious and safer therapies for their patients.
Keywords : Pharmacogenomics, pharmacokinetics, ADME, genotyping, technology
development
vii

Table of Contents
Résumé ..................................................................................................................... iii
Abstract ...................................................................................................................... v
List of Tables ...........................................................................................................xv
List of Figures ....................................................................................................... xvii
Dedication and Acknowledgements ..................................................................... xxii
1 Introduction .......................................................................................................... 1
1.1 Project Rationale............................................................................................... 1
1.2 Objectives ......................................................................................................... 3
1.3 Pharmacokinetics .............................................................................................. 4
1.3.1 Absorption .................................................................................................. 5
1.3.2 Distribution ................................................................................................. 7
1.3.2.1 The Blood Brain Barrier ......................................................................... 9
1.3.3 Metabolism ...............................................................................................10
1.3.3.1 Phase I Drug Metabolism Enzymes .....................................................12
1.3.3.1.1 Cytochrome P450 Enzymes ...............................................................13
1.3.3.1.2 Non CYP Oxidative Metabolism .......................................................14
1.3.3.1.3 Phase I Reduction Reactions ..............................................................17
viii

1.3.3.1.4 Phase I Hydrolysis Reactions ............................................................17
1.3.3.2 Phase II Drug Metabolism Enzymes .....................................................17
1.3.3.2.1 Glucuronidation .................................................................................18
1.3.3.2.2 Glutathione Conjugation ....................................................................19
1.3.3.2.3 Acetylation .........................................................................................20
1.3.3.2.4 Sulfonation .........................................................................................21
1.3.3.2.5 Amino Acid Conjugation ...................................................................21
1.3.3.2.6 Methylation ........................................................................................22
1.3.4 Excretion ..................................................................................................22
1.3.5 Transporters ..............................................................................................23
1.3.5.1 Solute Carrier Proteins ..........................................................................24
1.3.5.2 ATP-binding Cassette Transporters ......................................................25
1.3.6 Modifiers of Drug Metabolism ................................................................26
1.3.6.1 Nuclear Receptors .................................................................................26
1.3.6.2 Aryl hydrocarbon receptor .................................................................28
1.3.6.3 Orphan Nuclear Receptors .................................................................28
1.3.6.4 Nuclear factor-erythoroid 2 p45-related factor 2 ...............................30
ix

1.4 Pharmacodynamics .........................................................................................30
1.4.1 KRAS and Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitors ......................31
1.5 Genetics of Complex Traits ...........................................................................32
1.5.1 Candidate Gene versus Genome-wide .........................................................32
1.5.2 Statistics in Genetic Association Studies .....................................................36
1.5.2.1 Quality Measures ..................................................................................36
1.5.2.2 Testing for Association .........................................................................37
1.5.2.3 Reasons for Spurious Associations .......................................................37
1.5.3 Bioinformatics .............................................................................................39
1.6 Pharmacogenetics and Pharmacogenomics ....................................................42
1.6.1 Pharmacogenomic Examples .......................................................................44
1.6.1.1 Warfarin ................................................................................................44
1.6.1.2 Clopidogrel ........................................................................................48
1.6.1.3 Thiopurine Drugs ...............................................................................50
1.6.2 Genome wide Association Studies in Pharmacogenomics ......................52
1.6.3 In Vivo Probe Drugs ................................................................................53
1.7 Genotyping Technologies ...............................................................................55