universidade de brasília faculdade de agronomia e medicina veterinária

109 Pages·2009·0.85 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO ESPERMATOZÓIDE BOVINO CRIOPRESERVADO
APÓS SEXAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO E SUA UTILIZAÇÃO NA PRODUÇÃO IN
VITRO DE EMBRIÕES

JOSÉ DE OLIVEIRA CARVALHO NETO

DISERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS ANIMAIS

BRASÍLIA/DF
MAIO DE 2009
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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO ESPERMATOZÓIDE BOVINO CRIOPRESERVADO
APÓS SEXAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO E SUA UTILIZAÇÃO NA PRODUÇÃO IN
VITRO DE EMBRIÕES

José de Oliveira Carvalho Neto

Orientador: Roberto Sartori Filho

Co-orientador (a): Margot Alves Nunes Dode

Dissertação de Mestrado em Ciências Animais

014/2009

BRASÍLIA/DF
MAIO DE 2009
iii
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA E CATALOGAÇÃO

CARVALHO, J.O. Avaliação da qualidade do espermatozóide bovino criopreservado após
sexagem por citometria de fluxo e sua utilização na produção in vitro de embriões. Brasília:
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2009, 91p.
Dissertação de Mestrado.

Documento formal, autorizando reprodução desta
dissertação de mestrado para empréstimo ou
comercialização, exclusivamente pra fins acadêmicos, foi
passado pelo autor à Universidade de Brasília e acha-se
arquivado na Secretaria do Programa. O autor e o seu
orientador reservam para si os outros direitos autorais, de
publicação. Nenhuma parte desta dissertação de mestrado
pode ser reproduzida sem a autorização por escrito do
autor ou do seu orientador. Citações são estimuladas,
desde que citada à fonte.

FICHA CATOLGRÁFICA

CARVALHO, José de Oliveira. Avaliação da qualidade do espermatozóide
bovino criopreservado após sexagem por citometria de fluxo e sua
utilização na produção in vitro de embriões. Brasília: Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2009, 91p.
Dissertação de Mestrado. (Mestrado em Ciências Animais) – Faculdade
de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília, 2009.

1. Sexagem espermática. 2. Sexo dos embriões. 3. Desenvolvimento
embrionário. 4. Fecundação.

CDD ou CDU
Agris/FAO
iv
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO ESPERMATOZÓIDE BOVINO CRIOPRESERVADO
APÓS SEXAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO E SUA UTILIZAÇÃO NA PRODUÇÃO IN
VITRO DE EMBRIÕES

JOSÉ DE OLIVEIRA CARVALHO NETO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA
AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS ANIMAIS, COMO PARTE DOS
REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO
DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS
ANIMAIS.

APROVADA POR:

________________________________________________________________________
ROBERTO SARTORI FILHO, PhD (ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA
“LUIZ DE QUEIROZ” – ESALQ, USP)
(ORIENTADOR)

_________________________________________________________________________
CAROLINA MADEIRA LUCCI, Dr.(a) (UnB)
(EXAMINADOR INTERNO)

_________________________________________________________________________
SONY DIMAS BICUDO, Dr. (UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE
MESQUITA FILHO – FMVZ, UNESP)
(EXAMINADOR EXTERNO)

BRASÍLIA/DF, 28 de MAIO de 2009
v

À minha família, especialmente aos meus pais, Joaquim e Ana, que nos momentos de minha
ausência dedicados ao estudo, sempre fizeram entender que o futuro é feito da dedicação
constante no presente. Dedico a vocês minha conquista, com a mais profunda admiração,
respeito e carinho.
vi

“Cada um de nós teve na juventude uma
figura especial que, com paciência, afeto e
sabedoria, nos ajudou a escolher caminhos e
olhar o mundo por uma perspectiva
diferente”

Mitch Albom
vii
AGRADECIMENTOS

Ao meu pai por despertar em mim esta paixão. A minha mãe, que sempre me guiou
sabiamente. As minhas irmãs que sempre me incentivaram.

Aos meus avós que se alegram com cada vitória.

Aos meus padrinhos, que há muito são considerados como pais.

À co-orientadora, Margot Alves Nunes Dode, por tanto se dedicar a mim em seus
ensinamentos, orientação, paciência e estímulo.

Ao orientador Roberto Sartori Filho, pela oportunidade concedida, me acolhendo
sinceramente desde o princípio e orientando nos momentos necessários.

Às amigas Grazieli Marinheiro Machado, Juliana Azevedo e Amanda Lemes pelo auxílio
durante o desenvolvimento experimental.

À amiga Ligiane Leme, que me ensinou, cuidadosa e pacientemente, parte do que precisei
para realização deste trabalho.

Ao Prof. Gerson Barreto Mourão pela orientação e execução da análise estatística.

Aos pesquisadores Maurício Machaim Franco, Eduardo Mello e Rodolfo Rumpf e ao técnico
Regivaldo Vieira de Souza, pesquisadores de grande capacidade com os quais tive o
privilégio de conviver durante este período.

Aos amigos pós-graduandos e graduandos Allice Ferreira, Ana Cláudia Valeriano, Clarice
Laender, Edylaine Castro, Emivaldo Siqueira filho, Ester Caixeta, Fernanda Paulini, Flávia
Tuany, Heitor Teixeira, Jefferson Badaraco, Katlen Driesen, Marcelo Moura, Maria Clara
Mattos, Michele Bastos, Monique Guardieiro, Nádia Fagundes, Tatiana Campos, Tatiane
Mundin, Tiago Diesel e Valquíria Lacerda, cujo convívio proporcionou momentos de alegria,
mas também de aprendizado para o crescimento pessoal e profissional.
viii

À EMBRAPA recursos genéticos e biotecnologia, pelo suporte para que este experimento
pudesse ser realizado.

Aos funcionários da EMBRAPA pelo apoio durante o desenvolvimento do projeto.

À Universidade de Brasília pelo curso oferecido.

A todos aqueles que de alguma forma estiveram juntos durante este período, e que não
tiveram os nomes citados nestas linhas. Tenham certeza que lhes sou muito grato.
ix
ÍNDICE

Capítulos Página
LISTA DE FIGURAS xi
LISTA DE TABELAS xiii
RESUMO xiv
ABSTRACT xvi
CAPÍTULO 1
1 INTRODUÇÃO 01
1.2 OBJETIVO 04
1.3 HIPÓTESE 05
2 REVISÃO DE LITERATURA 06
2.1 ASPECTOS MORFOLÓGICOS E FUNCIONAIS DA CÉLULA
06
ESPERMÁTICA
2.1.1 CABEÇA 07
2.1.2 CAUDA 08
2.1.3 MEMBRANAS ESPERMÁTICAS 09
2.2 MECANISMOS ENVOLVIDOS NA FECUNDAÇÃO 10
2.3 AVALIAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS FÍSICAS E
13
MORFOLÓGICAS DO ESPERMATOZÓIDE
2.3.1 AVALIAÇÃO DA MOTILIDADE E MORFOLOGIA
14
ESPERMÁTICA
2.3.2 AVALIAÇÃO DE INTEGRIDADE DE MEMBRANA
16
PLASMÁTICA, ACROSSOMAL E CAPACITAÇÃO
2.3.3 AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DE CROMATINA 20
2.4 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DA CÉLULA ESPERMÁTICA 22
2.4.1 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES 22
2.5 IDENTIFICAÇÃO DO SEXO EM MAMÍFEROS 25
2.6 SELEÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES CONTENDO
26
CROMOSSOMO X OU Y
2.6.1 MÉTODOS IMUNOLÓGICOS PARA IDENTIFICAÇÃO
DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA ESPECÍFICAS DO
26
ESPERMATOZÓIDE CONTENDO CROMOSSOMO X OU
Y
2.6.2 DIFEREÇA NO CONTEÚDO DE DNA 27
2.6.2.1 SEXAGEM POR GRADIENTE DE
28
SEDIMENTAÇÃO OU CENTRIFUGAÇÃO
2.6.2.2 SEXAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO 29
3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 32
CAPÍTULO 2 46
1 RESUMO 47
2 ABSTRACT 49
3 INTRODUÇÃO 51
4 MATERIAL E MÉTODOS 53
4.1 REAGENTE 53
4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 53
4.3 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ESPERMÁTICOS 54
x
4.3.1 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA ESPERMÁTICA,
54
MORFOLOGIA E TAXA DE RECUPERAÇÃO
4.3.2 AVALIAÇÃO DA CAPACITAÇÃO, INTEGRIDADE DE
MEMBRANA PLASMÁTICA DO ACROSSOMA E DA 55
CROMATINA
4.4 PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO 58
4.4.1 RECUPERAÇÃO DE OVÓCITOS E MATURAÇÃO IN
58
VITRO
4.4.2 SELEÇÃO ESPERMÁTICA 59
4.4.3 FECUNDAÇÃO IN VITRO E CULTIVO DE EMBRIÕES 60
4.5 AVALIAÇÃO DA TAXA DE FECUNDAÇÃO E DO ESTÁGIO DE
60
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA 61
5 RESULTADO E DISCUSSÃO 62
5.1 RESULTADOS 62
5.2 DISCUSSÃO 71
6. CONCLUSÃO 79
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 80
ANEXO 86