Table Of ContentLIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
Jurgita Gedminaitė
KRŪTIES VĖŽIU SERGANČIŲ
MOTERŲ BRCA1, BRCA2, CHEK2 IR
NBS1 GENŲ MUTACIJŲ TYRIMAS IR
JŲ RYŠIO SU KITAIS PROGNOZINIAIS
VEIKSNIAIS PAIEŠKA
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai,
medicina (06B)
Kaunas, 2013
1
Disertacija rengta 2008–2012 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete
Mokslinis vadovas
prof. dr. Elona Juozaitytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,
Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)
2
TURINYS
SANTRUMPOS .................................................................................................................... 5
ĮVADAS ................................................................................................................................ 6
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ............................................................................. 8
2. DARBO AKTUALUMAS IR NAUJUMAS ................................................................... 9
3. LITERATŪROS APŽVALGA ...................................................................................... 10
3.1. Krūties vėžio etiopatogenezė ir prognoziniai bei predikciniai veiksniai .............. 10
3.2. Paveldimi BRCA1 ir BRCA2 genų pokyčiai ir jų sąsajos su krūties vėžiu ............ 14
3.2.1. BRCA1 ir BRCA2 genų funkcija ................................................................. 15
3.2.2. BRCA1 ir BRCA2 genų mutacijų paplitimas ir jų nustatymo aspektai ...... 15
3.2.3. BRCA1 ir BRCA2 genų mutacijos ir kitų navikų rizika .............................. 19
3.2.4. Su BRCA1 bei BRCA2 – susijusio krūties vėžio klinikiniai ir
morfologiniai ypatumai .............................................................................. 19
3.2.5. BRCA1 ir BRCA2 genų mutacijų prognozinė ir predikcinė reikšmė .......... 21
3.3. Paveldimi CHEK2 geno pokyčiai ir jų sąsajos su krūties vėžiu ............................ 23
3.3.1. CHEK2 geno funkcijos ............................................................................... 23
3.3.2. CHEK2 geno mutacijų paplitimas ir krūties vėžio rizika ........................... 24
3.3.3. CHEK2 geno mutacijos ir kitų navikų rizika .............................................. 28
3.3.4. Su CHEK2 mutacijomis susijusio krūties vėžio klinikiniai ir
morfologiniai ypatumai .............................................................................. 29
3.3.5. CHEK2 geno mutacijų prognozinė ir predikcinė reikšmė .......................... 29
3.4. Paveldimi NBS1 geno pokyčiai ir jų sąsajos su krūties vėžiu ................................ 30
3.4.1. NBS1 geno funkcija .................................................................................... 31
3.4.2. NBS1 geno mutacijų paplitimas ir piktybinių navikų rizika ....................... 32
3.4.3. Krūties vėžio rizika NBS1 geno mutacijų nešiotojoms ............................... 32
3.4.4. NBS1 geno mutacijų prognozinė ir predikcinė reikšmė .............................. 33
4. TIRIAMIEJI IR TYRIMO METODAI .......................................................................... 34
4.1. Tiriamųjų atranka ir tyrimo eiga ............................................................................ 34
4.1.1. Tiriamųjų atranka ....................................................................................... 34
4.1.2. Pacienčių charakteristikos .......................................................................... 36
4.1.3. Tyrimo eiga ................................................................................................ 37
4.2. Tyrimo metodai ..................................................................................................... 37
4.2.1. DNR išskyrimas ......................................................................................... 37
4.2.2. BRCA1 ir BRCA2 genų mutacijų tyrimo metodika ..................................... 37
4.2.3. CHEK2 geno mutacijų tyrimo metodika .................................................... 41
4.2.4. NBS1 geno mutacijų tyrimo metodika ........................................................ 45
4.3. Statistinė analizė .................................................................................................... 49
4.4. Etiniai tyrimo aspektai ........................................................................................... 51
3
5. REZULTATAI ............................................................................................................... 52
5.1. BRCA1, BRCA2, CHEK2 bei NBS1 genų mutacijos tiriamoje pacienčių
grupėje ................................................................................................................... 52
5.1.1. BRCA1 geno mutacijos ............................................................................... 54
5.1.2. CHEK2 geno mutacijos .............................................................................. 57
5.2. BRCA1 bei CHEK2 mutacijų ryšys su pacienčių amžiumi .................................... 60
5.3. BRCA1 ir CHEK2 mutacijų ryšys su šeimine krūties vėžio anamneze .................. 65
5.4. BRCA1 bei CHEK2 genų mutacijų ryšio su klinikinėmis bei morfologinėmis
krūties navikų savybėmis tyrimas .......................................................................... 67
5.4.1. BRCA1 mutacijų sąsajos su klinikinėmis bei morfologinėmis krūties
navikų savybėmis ....................................................................................... 67
5.4.2. CHEK2 mutacijų ryšys su klinikinėmis bei morfologinėmis krūties
navikų savybėmis ....................................................................................... 71
5.5. BRCA1 ir CHEK2 mutacijų įtakos ligos eigai tyrimas .......................................... 74
5.5.1. BRCA1 mutacijų įtaka ligos eigai ............................................................... 79
5.5.2. CHEK2 mutacijų įtaka ligos eigai .............................................................. 80
5.5.3. BRCA1 ir CHEK2 mutacijų įtaka ligos progresavimui ............................... 81
5.6. BRCA1 ir CHEK2 mutacijų radimo bei ligos progresavimo prognozavimo
modelių kūrimas .................................................................................................... 84
5.6.1. BRCA1 geno mutacijų radimo prognozavimas ........................................... 84
5.6.2. CHEK2 geno mutacijų radimo prognozavimas .......................................... 88
5.6.3. Ligos progresavimo prognozavimas ........................................................... 90
6. REZULTATŲ APTARIMAS ........................................................................................ 94
IŠVADOS .......................................................................................................................... 103
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ................................................................................ 104
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ........................................................................................ 105
PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA ....................................................................... 120
PRIEDAI ........................................................................................................................... 121
1 priedas ...................................................................................................................... 121
2 priedas ...................................................................................................................... 123
PADĖKA ........................................................................................................................... 125
4
SANTRUMPOS
ASA – alelio specifinė amplifikacija
ATM – ataksijos-telangiektazijos genas (angl. ataxia telangiectasia mutated
gene)
bp – bazių pora
BRCA1 – krūties vėžio genas 1 (angl. breast cancer 1, early onset gene)
BRCA2 – krūties vėžio genas 2 (angl. breast cancer 2, early onset gene)
CHEK2 – patikros punkto kinazės 2 genas (angl. checkpoint kinase 2 gene)
DNR – deoksiribonukleorūgštis
DT – duomenų tyryba
ER – estrogenų receptorius
FISH – fluorescentinė in situ hibridizacija
G – naviko diferenciacijos laipsnis
GS – galimybių santykis
GTŽV – gaubtinės/tiesiosios žarnos vėžys
HER2 – žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptorius 2
KŠV – kiaušidžių vėžys
KV – krūties vėžys
LFS – Li-Fraumeni sindromas
LSMU MA MF – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos
Medicinos fakultetas
n – atvejų arba tiriamųjų skaičius
NBS1 – Nijmegen’o sindromą sukeliantis genas (angl. Nijmegen breakage
syndrome 1 mutated gene)
NBS – Nijmegen’o sindromas
NT – netirta
p – reikšmingumo lygmuo
PGR – polimerazinė grandininė reakcija
PI – pasikliautinumo intervalas
pN – morfologiškai nustatyta sritinių limfmazgių būklė
PR – progesterono receptorius
pT – morfologiškai nustatytas naviko dydis
RFIP – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas
SN – standartinis nuokrypis
SP – santykinė paklaida
SR – santykinė rizika
SV – santykiniai vienetai
ŠA – šeiminė anamnezė
5
ĮVADAS
Per pastaruosius dešimtmečius onkologijos moksle pasiekta daug laimė-
jimų, kurie reikšmingai įtakojo ir krūties vėžiu sergančių moterų prognozę.
Nors daugelyje Europos šalių sergamumas krūties vėžiu didėja, mirtingumas
nuo šios ligos nuo 1995 m. mažėja. Tai sąlygoja pagerėjusi navikų diagnos-
tika, augančios gydymo galimybės bei gydymo individualizavimas. Įdiegta
atrankinė moterų mamografinės patikros programa padeda nustatyti krūtų
navikus kuo ankstyvesnėse stadijose, kuriose didžiausia tikimybė pacientei
pasveikti. Lietuvoje daugiau nei pusė naujų krūties vėžio atvejų diagno-
zuojami I–II stadijoje ir 1-erių metų kumuliatyvinis šia liga sergančių mote-
rų išgyvenamumas siekia 94 proc. [1]. Gerėjančias krūties vėžio išeitis
įtakoja naujausių gydymo metodų prieinamumas. Naudojant sparčiai gilė-
jančias žinias apie navikų genomiką ir ląstelių biologiją, kuriami labiau
efektyvūs ir mažiau toksiški gydymo metodai. Genų raiškos tyrimai parodė
penkis krūties vėžio subtipus, kurie turi skirtingas biologines savybes, klini-
kines išeitis, atsaką į chemoterapiją ir padeda pasiūlyti pacientėms tikėtinai
efektyviausią gydymo metodą. Nors epidemiologinių tyrimų rezultatai rodo,
kad mirtingumas nuo krūties vėžio mažėja, ši liga vis dar išlieka dažniausia
mirties priežastis tarp moterų, sergančių piktybiniais navikais. Tai skatina
ieškoti naujų diagnostikos ir gydymo galimybių, naujų prognozinių bei
predikcinių veiksnių.
Prieš du dešimtmečius mokslininkai kurdami genetinius modelius
išaiškino paveldimus genų pokyčius, kurie ženkliai padidina krūties navikų
vystymosi riziką. BRCA1 ir BRCA2 genai yra patys svarbiausi polinkį
susirgti krūties vėžiu sąlygojantys genai [2]. Jie koduoja to paties
pavadinimo baltymus, kurie dalyvauja daugybėje ląstelės funkcijų:
homologinėje rekombinantinėje reparacijoje, genomo stabilumo palaikyme,
transkripcijos reguliavime, chromatino remodeliacijoje, ląstelės ciklo
kontrolėje [3-4]. BRCA1 ir BRCA2 mutacijos sutrikdo koduojamų baltymų
funciją ir lemia padidėjusią ne tik krūties, bet ir kitų navikų – kiaušidžių,
kasos, prostatos, sėklidžių – riziką [5]. Tai didelio penetrantiškumo genai –
paveldimus patologinius jų pakitimus turinčioms moterims tikimybė, kad
gyvenimo bėgyje išsivystys krūties vėžys, siekia 78 proc., kai bendroje
populiacijoje ji svyruoja apie 12 proc. [6]. Kitas reikšmingai su padidėjusia
krūties navikų išsivystymo rizika susijęs genas – CHEK2 genas. Jo
koduojamas baltymas, vadinamas „patikros punkto kinaze 2“ (angl.
checkpoint kinase 2) yra labai svarbus ląstelės ciklo valdyme ir DNR
pažaidų atitaisyme [7]. Paveldimi patologiniai CHEK2 pakitimai sutrikdo
CHEK2 kinazės funkcijas, dėl ko padidėja onkogenezės rizika. Bene
6
labiausiai ištyrinėta šio geno mutacija c.1100delC lemia krūties navikų
riziką, kuri nedaug skiriasi nuo BRCA1 bei BRCA2 genų mutacijų
sąlygojamos rizikos: 70 metų amžiuje ji siekia 42 proc. [8]. Kaip paveldimą
krūties vėžį sąlygojantis buvo pastebėtas ir NBS1 genas (angl. Nijmegen
breakage syndrome 1 mutated gene), kuris nustatytas tiriant retą ligą,
vadinamą NBS sindromu (angl. Nijmegen breakage syndrome) [9]. Jis
koduoja baltymą nibriną, kuris taip pat dalyvauja DNR dvigubos grandinės
pažaidų atitaisyme, telomerų palaikyme ir užtikrina ląstelės ciklo patikros
punkto kontrolę [10]. Tyrimai parodė, kad dažniausiai šio sindromo atveju
nustatoma mutacija 657del5 reikšmingai padidina ne tik limfomos,
melanomos, priešinės liaukos, žarnyno, bet ir krūties vėžio riziką [11,12] ir
tam tikrose populiacijose gali lemti krūties navikų išsivystymą panašiu
dažniu kaip ir didelio penetrantiškumo BRCA1 geno mutacijos [13].
Atlikta daug tyrimų, kuriuose išanalizuota BRCA1/2, CHEK2, NBS1
genų mutacijų lemiama krūties vėžio rizika, bet nėra aišku, kokią įtaką šios
mutacijos turi sergančiai moteriai, atsakui į gydymą ir onkologinės ligos
eigai, kokios jų sąsajos su kitais prognoziniais vėžio veiksniais.
Šiame darbe ištyrėme paveldimas dažniausiai Europos regione nusta-
tomas BRCA1, BRCA2, CHEK2 bei NBS1 genų mutacijas jaunoms krūties
vėžiu susirgusioms moterims. Įvertinę šių genų paveldimų pakitimų dažnį,
analizavome jų sąsajas su pacienčių amžiumi, šeimine vėžio anamneze,
kitais prognoziniais veiksniais ir ligos išeitimis. Tuo pačiu ieškojome, kokie
žmogaus bei naviko požymiai galėtų palengvinti šių genų mutacijų radimo
prognozavimą ir pacienčių atranką genetiniam ištyrimui. Pradėjus kelią nuo
sergančio galima surasti dar nesergantį, bet turintį didelę navikų riziką
lemiančias genetines savybes individą ir sumažinti krūties ar kiaušidžių
vėžio išsivystymo riziką, taikant profilaktines chirurgines ar medikamen-
tines priemones. Ištyrėme, kokią jaunoms moterims išsivysčiusių krūties
navikų dalį sudaro paveldimas su BRCA1/2, CHEK2 bei NBS1 mutacijomis
susijęs vėžys, nustatėme demografinius, klinikinius bei morfologinius jo
ypatumus ir išanalizavome jo skirtumus nuo sporadinio vėžio, kurie gali
įtakoti diagnostikos ir gydymo pokyčius.
7
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Ištirti krūties vėžiu sergančių moterų BRCA1/2, CHEK2 ir NBS1 genų
mutacijas ir išanalizuoti jų ryšį su kitais prognozę įtakojančiais veiksniais.
Darbo uždaviniai
1. Įvertinti BRCA1, BRCA2, CHEK2 bei NBS1 genų mutacijų dažnį
tarp jaunų krūties vėžiu susirgusių moterų.
2. Nustatyti BRCA1 ir CHEK2 genų mutacijų ryšį su pacienčių amžiu-
mi, kuriame diagnozuotas krūties vėžys.
3. Ištirti sergančių krūties vėžiu šeiminės vėžio anamnezės ryšį su
BRCA1 ir CHEK2 geno mutacijomis.
4. Išanalizuoti BRCA1 ir CHEK2 genų mutacijų sąsajas su kliniki-
nėmis ir morfologinėmis naviko savybėmis bei naviko receptorių
raiška.
5. Nustatyti BRCA1 ir CHEK2 genų mutacijų įtaką ankstyvo krūties
vėžio prognozei.
8
2. DARBO AKTUALUMAS IR NAUJUMAS
Krūties vėžys – dažniausia moterų onkologinė liga. Kasmet Lietuvoje
nustatoma per 1500 naujų krūties vėžio atvejų, penktadalis jų – moterims iki
50 metų [1,14]. 5–10 proc. visų krūties navikų atvejų sudaro paveldimas
vėžys. Atrasta daug genų, kurių mutacijos susijusios su krūties vėžio vysty-
musi: BRCA1 bei BRCA2, TP53, PTEN, HRAS1, CHEK2, NBS1, CDH1,
STK11, ATM.
Nors literatūroje daug publikacijų apie BRCA1 bei BRCA2 genų mutaci-
jas kaip krūties vėžio rizikos veiksnį, bet nėra pakankamai ištyrinėta jų įtaka
šios ligos eigai, o taip pat ryšys su kitais prognoziniais veiksniais – moters
amžiumi, kuriame išsivysto krūties vėžys, naviko klinikinėmis ir morfolo-
ginėmis charakteristikomis. Nėra nustatyta, kaip šeiminė vėžio anamnezė
atspindi genetinių tyrimų dėl BRCA1/2 genų mutacijų radinius. CHEK2
geno mutacijų paplitimas ir sąlygojama krūties vėžio rizika nustatyta dau-
gelyje populiacijų, tačiau nėra duomenų apie jų paplitimą Lietuvoje. Publi-
kacijų apie jų sąsajas su šeimine anamneze, moters amžiumi, krūties naviko
savybėmis nedaug. Nėra nustatyta, ar šio geno mutacijos įtakoja krūties
vėžio eigą. Publikacijos apie NBS1 geno mutacijas krūties navikais sergan-
čioms moterims retos viso pasaulio mastu, nėra ištyrinėtas jų ryšys su krū-
ties vėžio prognoziniais veiksniais.
Šiame darbe nustatytas BRCA1 geno mutacijų dažnis tarp jaunų moterų,
susirgusių krūties vėžiu, ištyrinėtos jų sąsajos su moters amžiumi, naviko
klinikinėmis ir morfologinėmis savybėmis. Išanalizuota šeiminės anamnezės
prognozinė vertė nustatant paveldimus BRCA1 geno pokyčius. Pirmą kartą
Lietuvoje pabandyta įsisavinti CHEK2, NBS1 tyrimą, nustatyta, kokios
CHEK2 geno mutacijos dažniausios. Nors NBS1 geno mutacijų nerasta, bet
įsisavinta metodika, kuri bus panaudota ateities tyrimams. Sukūrėme komp-
leksinį BRCA1 bei CHEK2 genų mutacijų radimo prognozavimo modelį.
Šiandien klinikinėje praktikoje panašūs modeliai naudojami įvertinti
BRCA1/2 genų mutacijų tikimybę. Jų pritaikomumas ir specifiškumas skir-
tingose etninėse grupėse gali skirtis. Naudodami mūsų pacienčių charakte-
ristikas, įtraukdami ne tik šeiminę anamnezę, asmens ypatybes, bet ir klini-
kinius bei molekulinius navikų požymius, nustatėme kriterijus, kurie padės
atrinkti pacientes genetiniam konsultavimui dėl BRCA1 bei CHEK2 genų
mutacijų. Šis naujas požiūris turi didžiulę praktinę naudą.
9
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Krūties vėžio etiopatogenezė ir prognoziniai
bei predikciniai veiksniai
Krūties vėžio išsivystymą įtakoja daug veiksnių. Tai dieta, fizinis akty-
vumas, kūno masės indeksas, psichologinė moters būklė. Labai svarbus
veiksnys – endogeninių hormonų pusiausvyra. Didelė endogeninių estro-
genų koncentracija ir prailgėjęs jų poveikis, kurį atspindi ankstyva menarchė
bei vėlyva menopauzė, padidina krūties vėžio riziką. Moterims, kurių
mėnesinės prasidėjo jaunesnėms nei 12 metų, rizika susirgti buvo 20 proc.
didesnė nei toms, kurių mėnesinės prasidėjo po 14 metų [15]. Moterys,
kurioms menopauzė prasidėjo sulaukus 55 metų ir vėliau, turi dukart
didesnę riziką susirgti krūties vėžiu nei moterys, kurioms menopauzė
prasidėjo iki 45 metų [16]. Krūties navikų vystymąsi gali įtakoti ir egzoge-
niniai estrogenai. Duomenys apie kontraceptikų poveikį krūties liaukos
ląstelėms ir jų įtaką krūties navikų išsivystymui prieštaringi. Kai kurie
tyrimai rodė padidėjusią krūties vėžio riziką moterims, kurios pradėjo
vartoti kontraceptikus iki 18 metų ir vartojo ilgiau nei dešimt metų [16].
Ilgalaikis (daugiau nei 10 metų) pakaitinės hormonoterapijos vartojimas yra
susijęs su padidėjusia krūties navikų vystymosi rizika. Priešingai, trumpa-
laikis hormonoterapijos vartojimas po menopauzės nedidina šios ligos
rizikos, bet gali pabloginti mamografinės patikros diagnostines galimybes
[17]. Buvusi jonizuojamoji spinduliuotė taip pat padidina šios ligos išsivys-
tymo galimybę [16], ypatingai moterims, turinčioms paveldimus genų
pokyčius, kurie sąlygoja padidėjusią riziką susirgti piktybiniais navikais.
Patys stipriausi krūties vėžio rizikos veiksniai yra lytis ir amžius. Mo-
terys serga šia liga 100 kartų dažniau nei vyrai. Nuo 45 metų amžiaus
pradeda reikšmingai didėti diagnozuojamų krūties vėžio atvejų [18].
Sergamumą krūties vėžiu įtakoja ir etninė kilmė. Daugiaetninis kohorti-
nis tyrimas parodė, kad etninėse grupėse reikšmingai skiriasi estrogenų ir
progesterono receptorių raiška krūties navikų ląstelėse, nepriklausomai nuo
ligos stadijos. Pastebėta, kad Afrikos-Amerikos tamsiaodėms daug dažniau
vystosi hormonų receptorių neturintys krūtų navikai ir tai gali įtakoti jų
didelį mirtingumą nuo krūties vėžio [19]. Sergamumas ir mirtingumas nuo
krūties navikų labai skiriasi įvairiose šalyse. Tai įtakoja daug veiksnių, tarp
jų – gyvenimo būdas. Krūties vėžio riziką didina nutukimas, piktnaudžia-
vimas alkoholiniais gėrimais, mažas fizinis aktyvumas. Literatūros duome-
nimis, padidėjusią krūties vėžio riziką lemia ir geležies perteklius kraujyje,
10
Description:klasifikavimo ir euristinius algoritmus bei metodus pasikartojančių šablonų ir koreliacijų radimui – duomenų tyryba (DT). Caligo MA, Agata S, Aceto G, Crucianelli R, Manoukian S, Peissel B, et al. The CHEK2 c.1100delC mutation
