FCEN-UBA | Desbats, María Andrea. 2010

138 Pages·2012·5.42 MB·Spanish

by  Desbats, María Andrea

Tesis Doctoral
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Desbats, María Andrea
2010
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Cita tipo APA:
Desbats, María Andrea. (2010). Estudio de la dinámica y función de la ¨Proteína
Heterocromática 1 gama¨ durante el proceso de diferenciación celular. Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Desbats, María Andrea. "Estudio de la dinámica y función de la ¨Proteína Heterocromática 1
gama¨ durante el proceso de diferenciación celular". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires. 2010.
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Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 [phone]
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica

Estudio de la dinámica y función de la “Proteína
Heterocromática 1 gama” durante el proceso de
diferenciación celular

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos
Aires en el área de Química Biológica

Lic. María Andrea Desbats

Director de Tesis: Dra. Graciela Piwien Pilipuk
Consejero de Estudios: Dr. Eduardo Cánepa

Lugar de Trabajo: Fundación Instituto Leloir

Buenos Aires, 2010
Índice de Contenidos
Resumen en Castellano......................................................................................................1
Resumen en Inglés...............................................................................................................2
Abreviaturas..........................................................................................................................3
Introducción
I. Diferenciación celular...........................................................................................................4
II. Diferenciación adipocítica...................................................................................................4
2.1 Modelos de diferenciación adipocítica.................................................................................5
2.2 Cascada transcripcional durante la adipogénesis..................................................................6
III. Cromatina...........................................................................................................................7
3.1 Modificaciones de histonas y su importancia funcional......................................................9
3.2 Modificaciones asociadas a la represión de genes.............................................................10
3.3 Modificaciones asociadas a la activación de genes............................................................11
3.4 Modificaciones en células pluripotentes............................................................................11
3.5 Memoria epigenética..........................................................................................................11
IV. Organización de la cromatina durante la diferenciación celular................................12
V. HP1 (Heterocromatin Protein 1).......................................................................................13
5.1 Estructura de HP1...............................................................................................................16
5.2 HP1 y compañía.................................................................................................................17
5.3 Funciones de HP1...............................................................................................................17
5.4 HP1 y RNA........................................................................................................................19
5.5 HP1γ...................................................................................................................................20
5.6 Modificaciones postraduccionales de HP1.........................................................................21
VI. Compartimentalización del núcleo eucariota................................................................22
6.1 Territorios cromosómicos ..................................................................................................22
6.2 Fábricas de transcripción....................................................................................................24
6.3 RNA polimerasa II ............................................................................................................26
6.4 Compartimentos de factores de splicing (Splicing Speckles).............................................27
6.5 Lámina nuclear…...............................................................................................................28
6.6 Poros nucleares...................................................................................................................30
Problema de investigación, hipótesis de trabajo y objetivos..............................32
Materiales y métodos
I. Cultivos de líneas celulares...................................................................................................34
II. Inducción de la diferenciación.............................................................................................35
III. Inhibición de la transcripción.............................................................................................35
IV. Inhibición de la traducción.................................................................................................35
V. Inhibición de quinasas.........................................................................................................35
VI. Predicción de sitios de fosforilación de HP1γ con NetPhosK……...................................35
VII. Inmunofluorescencia indirecta (IFI).................................................................................36
VIII. Inducción de estrés celular por calor o Heat Shock.........................................................36
IX. Incorporación de BrdU (replicación).................................................................................37
X. Incorporación de BrUTP (transcripción).............................................................................37
XI. Extracción de proteínas nucleares......................................................................................37
XII. Tratamiento de células con RNAsas o DNAsas...............................................................37
XIII. Detección de mRNAs totales...........................................................................................37
XIX. Ensayos de interferencia..................................................................................................38
XV. Inmunoprecipitación de HP1γ.........................................................................................38
XVI. SDS PAGE......................................................................................................................39
XVII. Western Blotting.............................................................................................................39
XVIII. Descripción de los anticuerpos utilizados....................................................................40
XIX. Análisis estadístico..........................................................................................................40
Resultados
I. HP1γ se localiza polarizadamente en el núcleo durante la diferenciación de preadipocitos
3T3 L1......................................................................................................................................41
II. La polarización de HP1γ es un evento temprano y transitorio............................................43
III. La polarización de HP1γ es exclusiva de esta isoforma de HP1........................................44
IV. La polarización de HP1γ se asocia al proceso de diferenciación adipocítica....................45
V. La polarización de HP1γ no se correlaciona con la proliferación de los preadipocitos......48
VI. La polarización de HP1(cid:534) no ocurre en cualquier región nuclear......................................50
VII. La zona de polarización de HP1γ no se asocia a compartimentos nucleares
preexistentes.............................................................................................................................51

VIII. La zona de polarización nuclear de HP1γ presenta una distribución diferencial de
laminas......................................................................................................................................52
IX. La zona de polarización de HP1γ se excluye de heterocromatina pero se asocia a
modificaciones de histonas características de eucromatina.....................................................55
X. La polarización de HP1γ depende de la presencia de RNA y cromatina............................58
XI. HP1γ polarizada co-localiza con la RNA polimerasa II activa..........................................60

XII. En polo nuclear donde se concentra HP1γ se detecta una alta actividad
transcripcional..........................................................................................................................65
XIII. La polarización de HP1γ no se produce ante cualquier estímulo que produzca una
respuesta transcripcional en preadipocitos...............................................................................66
XIV. La polarización de HP1γ depende de la actividad transcripcional..................................68
XV. La inhibición de HP1γ aumenta la fracción de RNA pol II fosforilada extraíble del
núcleo.......................................................................................................................................70
XVI. HP1γ es necesaria para el reclutamiento de células a la actividad transcripcional.........72
XVII. La zona de polarización de HP1γ está enriquecida en RNAs mensajeros.....................74
XVIII. La polarización de HP1γ en Ser93 es regulada al inducirse la diferenciación de 3T3-
L1..............................................................................................................................................75
XIX. La polarización de HP1γ depende de la señalización por PKA............................................77
XX. HP1γ es requerida para la expresión de marcadores de diferenciación
adipocítica................................................................................................................................79
XXI. La polarización de HP1(cid:534) ocurre durante la diferenciación de neuroblastos N2a y
mioblastos C2C12....................................................................................................................81
XXII. HP1(cid:534) interactúa con pTEFb y Nup62............................................................................82
Discusión
I. La polarización de HP1γ como un nuevo y dinámico compartimento nuclear asociado a la
diferenciación adipocítica.........................................................................................................85
II. La polarización de HP1γ ocurre durante la diferenciación temprana..................................87
III. Características del ambiente nuclear en donde HP1γ se polariza.......................................88
IV. ¿Qué relación existe entre HP1γ y la adipogénesis?..........................................................91
V. La polarización de HP1 no es causa ni consecuencia de la respuesta
proliferativa..............................................................................................................................93
VI. HP1γ y Transcripción..................................................................................................................95
VII. La polarización nuclear de HP1γ como respuesta a la actividad transcripcional durante la
diferenciación...........................................................................................................................98
VIII. HP1γ y señalización.........................................................................................................99
XIX. HP1(cid:534) y los poros nucleares...........................................................................................100
X. Distribucióm nuclear asimétrica…...................................................................................101
XI. HP1γ polarizada y los territorios cromosómicos durante la diferenciación......................101
XII. Polarización nuclear de HP1γ durante la diferenciación celular........................................103
XIII. ¿Qué conceptos nuevos aportan nuestros resultados al campo?...................................105
Modelo final: Polarización de la expresión génica durante la diferenciación
celular..................................................................................................................................106
Bibliografía........................................................................................................................107
Anexo: Buffers y soluciones.........................................................................................129
Estudio de la Dinámica y Función de la Proteína Heterocromática 1
gama (HP1(cid:534)) Durante el Proceso de Diferenciación Celular

La diferenciación celular es un proceso complejo en el cuál un grupo específico de genes
se activa y el resto permanece silenciado. HP1γ se asocia a genes activos, pero se desconoce
su rol durante la diferenciación celular. En los preadipocitos HP1γ localiza tanto en hetero-
como eucromatina, pero cuando se induce la diferenciación HP1γ rápidamente se concentra
en un polo del núcleo excluyéndose de regiones heterocromáticas. La polarización de HP1γ
no se observa en células que no se diferencian. La fosforilación de HP1γ en Ser93 se induce
durante la adipogénesis y también se localiza polarizadamente. La polarización de HP1γ
depende de la transcripción, de la integridad del RNA y DNA, y de la señalización por PKA.
Interesantemente, marcas epigenéticas que marcan activa transcripción y la RNA pol II co-
localizan con HP1γ en dicho polo nuclear. Este dominio muestra altos niveles de
incorporación de BrUTP y de acumulación de mRNAs. La inhibición de HP1γ con siRNAs
disminuye la incorporación de BrUTP y la expresión de marcadores de diferenciación
adipocítica. Este dinámico patrón nuclear polarizado no se ha descripto antes, y proponemos
que podría constituir un nuevo mecanismo para regular la expresión de genes requeridos
durante el inicio de la diferenciación celular.

Palabras Clave: Genes, Diferenciación, Cromatina, Transcripción, Arquitectura Nuclear,
Envoltura Nuclear.
1
Study of the Dynamic and Function of Heterochromatin Protein 1
gamma (HP1(cid:534)) During the Process of Cell Differentiation.

Cell differentiation is a complex process in which a specific subset of genes is activated
while the rest of genes are silenced. HP1γ is associated to actively transcribed genes, however
little is known about its role during cell differentiation. In preadipocytes HP1(cid:534) localizes in
heterochromatic and euchromatic domains, but when preadipocytes are induced to differentiate
HP1γ rapidly concentrates in one pole of the nucleus being transiently excluded from
heterochromatin. HP1γ polarization is not observed in cells that do not differentiate. HP1(cid:534) P-
Ser93 is induced upon adipogenesis and also concentrates in a polarized manner. HP1(cid:534)
polarization depends on transcription, RNA and DNA integrity, and on PKA signalling.
Noteworthy, epigenetic marks that correlate with active transcription and RNA polymerase II
co-localizes with HP1γ in the nuclear pole. This domain shows high level of BrUTP
incorporation and mRNAs accumulation. Knock down of HP1γ by siRNAs causes a decrease in
BrUTP incorporation and a decrease in the expression of markers of adipocyte differentiation.
Importantly, to our knowledge this dynamic nuclear polarization has not been described before,
and we propose that it may constitute a novel mechanism for regulating the expression of a
determined subset of genes required during the initial steps of cell differentiation.

Keywords: Genes, Differentiation, Chromatin, Transcription, Nuclear Architecture, Nuclear
Envelope.
2
Abreviaturas
Ac: Anticuerpo
BSA: Seroalbúmina Bovina
IFI: Inmunofluorescencia Indirecta
IP: Inmunoprecipitación
KO: knock out
MS: Espectrometría de Masa
MW24: placa con 24 pocillos
nt: nucleótidos
ON: overnight, toda la noche
PM: Peso Molecular
SD: Desvío Estándar
SDS: Dodecil Sulfato de Sodio
SBA: Suero Bovino Adulto
SBF: Suero Bovino Fetal
siRNAs: ARNs de interferencia pequeños
TA: Temperatura Ambiente
WB: Western Blotting
P60: placa de 60 mm de diámetro
P100: placa de 100 mm de diámetro
P150:placa de 150 mm de diámetro

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